Проведения III-его этапа бактериологического исследования

с целью выделения гемофилов:

1. Проверьте однородность выделенной чистой культуры, сделайте мазок со скошенного СПА, окрасьте по Граму – Синеву, изучите под микроскопом, зарисуйте в дневник и сделайте заключение.

Заключение:

2. Ставят тест на способность к продукции цитохромоксидазы: материал исследуемой суточной агаровой культуры наносят на фильтровальную бумагу и добавляют 1 каплю 1%-ного свежеприготовленного водного раствора тетраметилпарафенилен -диамина гидрохлорида; при наличии цитохромоксидазы спустя 5-10 секунд развивается пурпурное окрашивание. В качестве позитивного контроля компонентов реакции следует использовать суточную агаровую культуру любой псевдомонады, в качестве негативного – кишечной палочки. Тест может быть выполнен непосредственно на поверхности чашки: в этом случае 1 капля реактива наносится на исследуемую колонию и учет результатов аналогичным образом производится спустя 23-30 сек.

Результат:_________________________________________________________

Заключение:_______________________________________________________

3. Ставят тест на способность к продукции каталазы: материал исследуемой суточной агаровой культуры суспензируют на поверхности предметного стекла в капле 3%- ного раствора перекиси водорода; спустя 3-5 сек во взвеси каталазапозитивной культуры происходит интенсивное газообразование. В качестве позитивного контроля следует использовать суточную культуру кишечной палочки, негативного – любого стрептококка.

Результат:_________________________________________________________

Заключение:______________________________________________________

4. Ставят тест на b- галактозидазу: в стерильные агглютинационные пробирки разливают по 0,5 мл раствора b - галактозидазы и вносят одну петлю культуры, инкубируют 37° С 2- 4 часа и появление ярко-желтого окрашивания за счет о-нитрофенола.

Результат:_________________________________________________________

Заключение:_______________________________________________________

5.Ставят тест на определение индолообразования: пробирки с питательным бульоном засевают одну петлю культуры и добавляют 2-3 капли инактивированной лошадиной сыворотки, под пробку помещают индикаторную бумажку на индол. При образовании индола при инкубации 37°С 18-24 часа,появляется розовое окрашивание индикаторной бумажки.

Результат:_________________________________________________________

Заключение:_______________________________________________________

6. Ставяттест на определение уреазы: в пробирки по 0,1 мл и вносят несколько капель густой суспензии исследуемой культуры в питательном бульоне, инкубируют 37^оС, 30 мин, среда приобретает малиново-красное окрашивание. Учет отрицательной реакции после 24 часов инкубации, цвет среды не изменяется.

Результат:_________________________________________________________

Заключение:_______________________________________________________

7. Ставят тест на наличие орнитиндекарбоксилазы: диски с орнитином помещают в пробирку с 0,3–0,5 мл физиологического раствора и добавляют несколько капель суточной бульонной культуры, после чего заливают стерильным вазелиновым маслом и инкубируют 37^оС 18–24 часа, появляется синее или интенсивное зеленое окрашивание.

Результат:________________________________________________________

Заключение:______________________________________________________

8. Ставят тест на определение потребности для роста X и Y факторов: приготовленная суспензия суточной культуры в питательном бульоне, засевают на 5% кровяной агар, на поверхность среды кладут стандартные

диски или полоски, пропитанные X и Y факторами, на расстояние 2 см друг от друга. Инкубируют 37^оС в атмосфере18–24 часа с 5–10% СО².

Учет характера роста производится визуально. Интенсивный рост бактерий вокруг дисков или полосок подтверждает наличие гемофилов.

9. Реакция определения феномена «набухания капсулы»: всвежевыделенной мокроте устанавливают набухание капсулы при воздействии соответствующих диагностических агглютинирующих сывороток, основано на появлении феномена набухания капсулы.

10. Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам методом диффузии в агаре на среде Мюллера-Хинтона с добавлением 5% дефибринированной крови человека, разлитой по чашкам с толщиной слоя агара 4 мм. Перед посевом подсушить чашки с приоткрытыми крышками при +25±5⁰С. Готовые чашки хранить не более 7 дней в холодильнике, в запаянном полиэтиленовом пакете. Берут 18-20-часовую агаровую культуру. В стерильном ИХН суспензируют 5-10 изолированных колоний и доводят до 0,5 мутности по оптическому стандарту Mc Farland. Стерильный ватный тампон поместить в пробирку с инокулятом. Излишнюю жидкость с тампона убрать путем покручивания тампона, прижатого к стенке пробирки над уровнем жидкости в разные стороны. Посев культуры на каждую чашку произвести штрихообразным движением по всей поверхности агара трижды, каждый раз после аппликации поворачивая чашку вокруг своей оси на 60⁰. В заключении тампоном обводят по краям агаровой поверхности. Диски с помощью стерильного пинцета наложить на поверхность засеянной питательной среды на расстоянии от края чашки 1,5-2см и на одинаковом расстоянии (около 3 см) друг от друга, не более 6-7 дисков на чашку, слегка прижимая их к поверхности среды. Сразу после наложения дисков чашки закрыть крышками и инкубировать при 37⁰С 24 часа. Чашки извлечь из термостата, поместить кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом в 45⁰ (учет в отраженном свете). При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на полную ингибицию видимого роста.

Рекомендуемые диски с антибиотиками: ципрофлоксацин, тетрациклин, хлорамфеникол, амоксициллин, меропенем, цефтазидим.

Учтите результаты по демонстрационной пробе и сделайте заключение с учетом результатов всех тестов идентификации выделенного штамма.

Результат пробы на антибиотики: (см. Приложение №5)

1._________________________________________________________________

 

2.______________________________________________________________

 

3.________________________________________________________________

 

4. ____________________________________________________________

 

5._____________________________________________________________

 

6._________________________________________________________________

Заключение:

Задание 8

1. Изучите экспресс – методы обнаружения капсульного антигена (латекс-агглютинация, коагглютинация со стафилококковым протеином А, реакция встречного иммуноэлектрофореза). Вспомогательный метод диагностики менингококковой инфекции - реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации

Для диагностики заболеваний, вызванных палочкой инфлюэнцы, используют РИФ. В настоящее время предложены иммунологические методики выявления капсульного антигена H. influenzae типа b в ликворе, крови, плевральной жидкости и моче: латекс-агглютинация, коагглютинация со стафилококковым протеином А, встречный иммуноэлектрофорез.

Реакция латекс - агглютинации (экспресс-метод)

Метод латекс - агглютинации, позволяющий в течение 15 мин дать заключение об отсутствии или наличии в спинномозговой жидкости больного специфических антигенов. Реакцию проводят при наличии признаков гнойного воспаления в ликворе и при бактериоскопическом обнаружении в нем возбудителей. Предварительно спинномозговую жидкость необходимо прогреть в течение 5 мин при 100 °С и центрифугировать при 1500 - 2000 об./мин. Для проведения реакции используют прозрачную надосадочную жидкость.

Ход исследования: одну каплю каждого латексного реактива (предварительно реактивы рекомендуется тщательно встряхнуть) наносят на специальные бумажные карты, приложенные к набору, добавляют 0, 3 мл спинномозговой жидкости (надосадочная фракция). Перемешивают чистым аппликатором. Осторожно покачивают бумажную карту. Агглютинация в течение 2 мин с одним из латекс - диагностических препаратов свидетельствует о присутствии в испытуемом образце специфического антигена.

Встречный иммуноэлектрофорез (экспресс-метод)

Реакция позволяет с помощью специфических антисывороток выявлять полисахаридный антиген возбудителя в спинномозговой жидкости или сыворотке крови больного уже в первый день исследования материала. Для проведения реакции необходимы: проба спинномозговой жидкости (осадок, если ликвор мутный) или сыворотка крови, преципитирующие антисыворотки, веронал - мединаловый буфер, 1 %-й агар на веронал - мединаловом буфере, любой аппарат для иммуноэлектрофореза, стеклянные пластины размером 9 и 12 см, трафареты, пробойники для агара, отсасывающие агар устройства, пастеровские пипетки или дозаторы с наконечниками, фильтровальная бумага, предметный столик или другой объект с идеально ровной поверхностью. В аппарат для иммуноэлектрофореза заливают веронал - мединаловый буфер, содержащий в 1 л дистиллированной воды 21,9 г мединала и 3,35 г веронала (веронал предварительно нагревают на водяной бане в небольшом количестве дистиллированной воды до полного растворения). Измеряют рН и доводят его до уровня 8,6. Далее на веронал - мединаловом буфере (предварительно развести дистиллированной водой в 4 раза) готовят 1 % агар.

Ход исследования: на 100 мл буфера добавляют 1 г агара, нагревают на водяной бане до полного растворения и в горячем, но несколько охлажденном виде (60 - 70 °С) в количестве 20 мл наносят на стеклянные пластины размером 9 и 12 см. Пластину предварительно помещают на ровную горизонтальную поверхность. После застывания агара специальным пробойником или металлической трубкой с диаметром 3 мм высекают два параллельных ряда отверстий по длине стекла на расстоянии 3 мм друг от друга. Специфические антисыворотки вносят в лунки агара со стороны анода (+), а испытуемую пробу спинномозговой жидкости или сыворотку крови - со стороны катода (-). В отдельные лунки помещают положительный контроль. В качестве положительного контроля используют антигенный препарат (полисахарид) и гомологичную антисыворотку. Подготовленную пластину помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза, соединяют стекло и буфер с помощью фильтровальной бумаги и включают аппарат в сеть. Время экспозиции 20 - 30 мин при силе тока 12 ма. Результат учитывают через 10 мин после выключения аппарата. Реакцию считают положительной, если между лунками проявляются четкие линии преципитации, которые хорошо видны в проходящем свете. Рекомендуется проведение повторного и окончательного учета результатов реакции через 24 ч, при этом стекла хранят во влажной камере или в эксикаторе с влажной атмосферой.

Реакция коагглютинации (экспресс-метод) -серологический тест, в котором используются стафилококки (носитель протеина А,по отношению к иммуноглобулинуС). Такой носитель, погруженный специфическими антителами, представляет собой диагностикум, который позволяет эффективно проводить детекцию разнообразных растворимых антигенов, а также антител.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Исследование сыворотки больного в реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации позволяет существенно увеличить процент лабораторного подтверждения генерализованных форм менингококковой инфекции. Для получения достоверного результата обязательным условием является исследование сывороток крови больного в динамике, т.е. взятых в разные сроки заболевания (на 1-й и 10 - 12-й дни заболевания). Одной из модификаций микрометода является постановка РНГА в полистироловых пластинах с объемом лунок не менее 300 мл с использованием автоматических дозаторов на 0,5 и 1 мл. Необходимые реагенты: диагностикумы эритроцитарные менингококковые полисахаридные серогрупп А и С; исследуемая сыворотка, разведенная 1:5; забуференный физиологический раствор (ЗФР).

Ход исследования: два ряда полистироловой пластины (для выявления антител к менингококкам серогрупп А и С) заполняют по 1 мл ЗФР, затем проводят двукратное титрование исследуемой сыворотки с разведения 1:5. В каждый ряд добавляют по 0,5 мл соответствующего диагностикума. Пластину встряхивают и помещают в термостат на 2,0 - 2,5 ч при 37 °С, после чего учитывают результаты. Обязательными контролями служит отсутствие спонтанной агглютинации диагностикума и исследуемой сыворотки. Для этого к 1мл диагностикума добавляют 0, 50 мл ЗФР, а к 1 мл сыворотки -0, 5 мл 1 %-х эритроцитов барана. Учет результатов РНГА проводят по четырехкрестной системе. Четырехкратное и более нарастание титра специфических антител в процессе болезни служит подтверждением диагноза.

Экспресс-метод – иммуноиндикация с помощью реакции иммунофлюоресценции со специфической сывороткой типа b (используют при диагностике менингитов).

 

 

Оценка ___________

Подпись преподавателя ______________

Приложение № 1