Повторы в генах, ответственных за «обслуживание» генома и приобретение генетической информации.

Недавно обнаружилась ещё одна функция повторов. Обычно инвертированные повторы обнаруживались по всему геному у различных бактерий после кодирующих последовательностей, выполняя функции терминаторов транскрипции. Однако анализ геномов N.meningitidis, N.gonorrhoeae и H.influenzae выявил присутствие одиночных частей инвертированных повторов в составе генов. Дальнейшие исследования показали, что обнаруженные части повторов являются ничем иным, как сайтами интеграции фрагментов трансформирующей ДНК. Они были обозначены DUS (DNA uptake sequences). Последовательность DUS в составе генов нейссерий имеет вид: 5^/-GGCCGTCTGAA-3^/. Геном нейссерий содержит 1900 копий, а геном H.influenzae – 1471 копию DUS. Изучение распределения DUS в различных генах показало, что намного чаще DUS встречаются в генах, ответственных за процессы репарации, рекомбинации, рестрикции-модификации и репликации, чем в любых других генах (11). Остаётся неясным, почему вне генов DUS представлены в виде повторов, а внутри генов, как правило, в виде неповторяющихся последовательностей.

Причина преимущественного нахождения DUS в составе генов, ответственных за сохранение ДНК окончательно неясна, как неясны и механизмы, определяющие такое распределение и сохранение этих повторов. Предположение сводится к следующему. Гены репарации рекомбинации, рестрикции-модификации и репликации чрезвычайно важны для клетки. В случае их повреждения клетка может оказаться обречённой на гибель. В неблагоприятных стрессовых условиях, значительная доля микробной популяции, действительно, погибает. Однако меньшая доля клеток, имеющая в составе самых существенных генов DUS, будет в состоянии приобрести неповреждённые копии этих генов из лизатов погибших клеток за счёт трансформации. Такой механизм восстановления существенных генов незаменим во всех случаях, когда нарушается целостность генома, будь то мутации, или потеря генов за счёт делеций.

Итак, DUS способствуют приобретению участков ДНК (предположительно утраченных ранее или повреждённых) в бактериях природно-трансформабельных видов. Роль DUS в горизонтальном переносе пока не определена. Известно, однако, что механизм горизонтального переноса использует организованные инвертированные повторы в составе сайтов интеграции интегронов и сайтов, сцепленных с генами тРНК (см. 2). В указанных случаях повторы играют положительную для приобретения генетического материала роль.

Относительно недавно была открыта противоположная роль повторов. Она заключается в ограничении ассимиляции геномами бактерий и архей ДНК, поступающей извне. Эта система ограничения довольно сложна, является многокомпонентной и, с одной стороны имеет черты систем рестрикции-модификации, а с другой – черты иммунной системы. При этом иммунитет работает без участия принципа белок-белкового узнавания. Основу этой системы составляют повторы CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) (18, 19, 6, 25, 26 40).

CRISPR были открыты в геноме Escherichia coli в 1987 году (17).Они присутствуют в геномах примерно 40% бактерий и 90% архей. Сейчас очевидно, что CRISPR являются основной частью сложной системы защиты хозяина от проникновения (и ассимиляции) постороннего генетического материала. Система устроена следующим образом (Рис. 4). Каждый CRISPR локус состоит из палиндромных повторов размером 21 или 48 п.о., разделенных неповторяющимися спейсерами от 26 до 72 п.о. Обычно CRISPR локус содержит около 20 повторов, но их количество может достигать 300. Обычно бактериальные или архейные геномы содержат около 18 CRISPR локусов. В плазмидах CRISPR локусы встречаются редко. Очень важным оказался факт 100% гомологии спейсеров с геномами бактериофагов или плазмид. На этом основании было сделано заключение о том, что спейсеры – это части фаговых или плазмидных геномов. Обычно CRISPR сцеплены с генами cas (CRISPR associated sequences). Гены cas кодируют нуклеазы, геликазы и ДНК-связывающие белки. Перед первым CRISPR повтором находится промотор. CRISPR локус обычно транскрибируется в том же направлении, что и прилежащие гены cas.

Поступающая в бактериальную клетку фаговая или плазмидная ДНК подвергается атаке cas- нуклеаз. Образовавшийся фрагмент(ы) встраивается в проксимальную область одного или нескольких CRISPR локусов, образуя первый спейсер. Внедрение нового спейсера иногда сопровождается исключением одного из внутренних спейсеров. Это происходит за счёт гомологичной рекомбинации можду фланкирующими внутренний спейсер повторами. Теперь выжившие клетки несут в CRISPR локусе часть фагового или плазмидного генома, и являются иммунными к повторному заражению данным фагом или плазмидой. Если такое заражение происходит, имеет место следующая последовательность событий. CRISPR-транскрипт подвергается атаке cas- нуклеаз, образуются мелкие crРНК. Эти РНК связываются с поступившей в клетку чужеродной фаговой или плазмидной ДНК. При этом связывание происходит как с сенс-, так и с антисенс-цепями. Образовавшиеся ДНК-РНК гибриды подвергаются атаке cas- нуклеаз, что приводит к их инактивации. Установлено, что в некоторых видах бактерий и архей CRISPR- cas система может атаковать не только ДНК, но и мРНК. Важно отметить существование специфичности во взаимодействии CRISPR локусов и cas- нуклеаз: cas- ферменты активны только относительно «своих» CRISPR. Один из генов cas отвечает за внедрения новых спейсеров, а другие – за формирование устойчивости к чужеродной ДНК.

Хотя в целом организация и работа этой сложной системы понятны, многие её детали ещё предстоит выяснить. Так, например, неизвестна природа специфичности механизма, внедряющего вновь поступивший в бактерию фрагмент чужеродной ДНК на место проксимального спейсера. Целесообразность этого механизма очевидна. Проксимальный спейсер транскрибируется намного эффективнее, чем дистальные. Поэтому напряжённость иммунитета будет гораздо выше относительно ДНК, вошедшей в клетку последней, чем относительно ДНК, проникавшей в бактерию раньше. То есть бактерия защищает себя от «сегодняшней» угрозы активнее, чем от угрозы «позавчерашней». Неизвестна также природа специфичности cas- нуклеаз относительно «своих» CRISPR локусов. Неясна и природа сигнала, активирующего рекомбинацию, которая приводит к удалению одного из внутренних CRISPR-повторов в CRISPR локусе в ответ на внедрение нового проксимального спейсера.

Возможно, именно присутствие CRISPR- cas системы в геномах большинства видов архей обеспечило относительную гомогенность размеров их геномов. Непонятной остаётся причина, по которой 90% архей унаследовали и закрепили систему CRISPR- cas, тогда как у бактерий эта система наличествует только в 40% случаев.

Будучи предназначенными для ограничения горизонтального переноса генетического материала, сами CRISPR локусы могут передаваться горизонтально с помощью плазмид или фагов. Их интеграции в геном способствуют фланкирующие IS-элементы.

Экспериментальные данные, суммированные в данной работе, определённо указывают на существование в геномах бактерий сайтов, предназначенных для ассимиляции чужеродной ДНК. Это интегроны, сайты интеграции, сцепленные с генами тРНК, сайты интеграции ДНК умеренных бактериофагов, элементы DUS. Все без исключения сайты интеграции образованы повторами. Эти сайты существуют не сами по себе, а являются частями очень специфических и сложных генетически детерминированных механизмов, направленных на поглощение ДНК извне и её ассимиляцию геномами-реципиентами. В результате в геномы-реципиенты внедряются участки чужеродной ДНК от фрагментов «чужих» генов до геномных островов и целых геномов умеренных фагов. Наряду с этим, повторы образуют и другие системы (CRISPR-cas), направленные на ограничение ассимиляции геномами ДНК, поступившей извне. И это не единственный способ защиты. Вспомним классические системы рестрикции-модификации.

Таким образом, в ходе эволюции сформировались противоположно направленные системы, одна группа которых способствует приобретению новой ДНК геномами, а другая ограничивает этот процесс. Что обеспечивает баланс между этими силами абсолютно неизвестно.