Визначення активності каталази крові

Принцип методу: активність каталази крові визначають за кількістю розкладеного пероксиду водню за одиницю часу. Кількість пероксиду водню визначається за титрометричним методом згідно з реакцією

2КмnO₄ + 5H₂O₂ + 4H₂SO₄ → 2KHSO₄ + 2MnO₄ + 8H₂O + 5O₂.

Різниця кількості КмnO₄, використана на титрування до і після дії каталази, характеризує активність ферменту. Більш об΄єктивною одиницею є показник каталази, а не каталазне число, оскільки фермент виявляється майже виключно в еритроцитах (див. КДЗ).

Хід роботи: розведення крові у 1000 разів: у мірну колбу ємністю 100 мл наливають 10 мл дистильованої води і додають 0,1 мл крові. Перемішують, доливають дистильованої води до мітки (1 мл гемолізату містить 1 мкл крові).

У дві колбочки вливають по 1 мл розведеної крові, додають по 7 мл дистильованої і по 2 мл 1% розчину пероксиду водню. У контрольну пробу (перша колбочка) відразу ж наливають 5 мл 10% розчину сірчаної кислоти (дія каталази в кислому середовищі припиняється). Колбочки залишають при кімнатній температурі на 30 хв, періодично перемішуючи. Потім у другу колбочку (дослід) доливають 5 мл 10% розчину Н₂SО₄. Вміст кожної колбочки титрують 0,1 н розчином КМnО₄ до рожевого кольору. Розраховують каталазне число (КЧ) за формулою

КЧ = (А-В) · 1,7,

де А – кількість 0,1 н КМnО₄, яка використана на титрування контрольної проби;

В - кількість 0,1 н КМnО₄, яка використана на титрування дослідної проби.

Примітка. Грам-еквівалент Н₂О₂ = 17 г

Отже, в 1 мл 0,1 н розчину міститься 1,7 мг Н₂О₂. Оскільки

1 мл 0,1 н КМnО₄ еквівалентний 1 мл 0,1 н Н₂О₂, то помноживши 1,7 мг на різницю між кількістю КМnО₄, затраченою на титрування контрольної і дослідної проб, отримують кількість міліграмів Н₂О₂, яка розщеплюється в 1 мкл крові, тобто безпосередньо каталазне число.

Клініко-діагностичне значення. У нормі КЧ коливається від 10 до 15 одиниць. Каталаза (Н₂О₂:Н₂О₂-оксидоредуктаза) розщеплює пероксид водню з утворенням молекулярного кисню і води:

Каталаза

2Н₂О₂ О₂ + 2Н₂О.

Простетична група каталази побудована за типом гему гемоглобіну. Цей фермент міститься у всіх тканинах організму, але найбільш активний він в еритроцитах і печінці. Біологічна роль каталази полягає в знешкодженні пероксиду водню, який утворюється в процесі окисно-відновних реакцій в організмі. Активність каталази виражають каталазним числом і показником каталази. Каталазним числом називається кількість міліграмів пероксиду водню, яка розкладається каталазою в 1 мкл крові за 30 хв. Показником каталази називають дріб, у якому чисельником є каталазне число, а знаменником – число мільйонів еритроцитів в 1 мкл досліджуваної крові. Активність каталази знижується при анемії, туберкульозі, ракових захворюваннях; підвищується за умов токсичного гепатиту, дії іонізуючого випромінювання, солей важких металів.

Після проведення експериментальної частини ви повинні оформити протокол лабораторної роботи.

 

Виконайте завдання та перевірте правильність їх розв’язання з еталоном відповіді.

Завдання 1

Судово-медичний експерт під час розтину тіла 20-річної дівчини встановив, що смерть настала внаслідок отруєння ціанідами. Порушення якого процесу найбільш імовірно стало причиною смерті дівчини?

А. Тканинного дихання.

В. Синтезу гемоглобіну.

С. Транспорту кисню гемоглобіном.

Д. Синтезу сечовини.

Е. Транспорту водню за допомогою малат-аспартатного механізму

Еталон відповіді: А.

Завдання 2

Як називається процес синтезу АТФ, що відбувається поєднано з реакціями окиснення за участю системи дихальних ферментів мітохондрій?

А. Окисне фосфорилювання.

В. Субстратне фосфорилювання.

С. Вільне окиснення.

 

Д. Фотосинтетичне фосфорилювання.

Е. Відновлювальне фосфорилювання.

Еталон відповіді: А.

Завдання 3

До складу дихального ланцюга входять всі нижче перелічені речовини, за винятком:

А. НАД, ФМН

В. Залізо-сірчаних білків.

С. Убіхінону.

Д. Пірувату.

Е. Цитохроми.

Еталон відповіді: Д.

Завдання 4

Коферментом НАДН₂-дегідрогенази в дихальному ланцюзі є:

А. ФАД.

В. НАД⁺.

С. ПАЛФ.

Д. ФМН.

Е. НАДФ.

Еталон відповіді: Д.

 

Завдання 5

Вилучення енергії від субстратів тканинного дихання в дихальному ланцюзі відбувається за рахунок:

А. Розщеплення субстратів до СО₂ і Н₂О.

В. Зростання окисно-відновного потенціалу компонентів дихального ланцюга.

С. Перенесення електронів по дихальному ланцюгові.

Д. Перетворення енергії відщеплених електронів у протонний потенціал внутрішньої мембрани мітохондрій.

Е. Відновлення кисню до води.

Еталон відповіді: Д.

 

Завдання 6

Заповніть таблицю “Ферменти біологічного окиснення в мітохондріях”

Пор. номер	Тип ферменту	Кофермент, кофактор	Схема реакції	Приклад

Короткі методичні вказівки до роботи студентів на практичному занятті

Заняття починається з розв’язання навчальних задач, після чого необхідно виконати лабораторний дослід.

У кінці заняття проводяться тестовий контроль, аналіз результатів роботи, в яких беруть участь всі студенти під керівництвом викладача.