Тема. Вивчення структури, фізико-хімічних властивостей та класифікації ферментів. Засвоєння методів виявлення ферментів у біологічних об’єктах

Актуальність теми. Ферменти як високоспецифічні біологічні каталізатори забезпечують проходження багатьох тисяч взаємозв’язаних хімічних реакцій синтезу, розщеплення, взаємоперетворень різноманітних органічних речовин з високою швидкістю. За рахунок ферментів відбуваються найважливіші процеси життєдіяльності: експресія генетичної інформації, біоенергетика, синтез і розщеплення молекул. Вивчення структури, функцій і молекулярних механізмів дії ферментів дозволяє розкрити суть основних процесів життєдіяльності, а також використовувати знання про природні каталізатори у хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості, медицині.

Мета загальна - уміти характеризувати ферменти як біологічні каталізатори, пояснювати основні принципи виявлення ферментів у біологічному матеріалі.

Конкретні цілі, уміти:

1. Характеризувати основні особливості ферментів як біологічних каталізаторів, пояснювати їх фізико-хімічні властивості.

2. Характеризувати структуру простих і складних ферментів.

3. Трактувати біохімічні закономірності будови та функціонування різних класів ферментів.

4. Класифікувати коферменти у відповідності до їх хімічної природи, типу реакції, яку вони каталізують.

5. Зображати структурні формули основних коферментів - похідних від вітамінів.

 

При підготовці до заняття користуйтеся літературою:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. - Київ; Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. - С. 86-97.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. - Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. - С. 66-70; 74–76; 93-97.

3. Мари Р. и соавт. Биохимия человека. – М.: МИР, 1993. – Т.1. - С. 63-68; 81-83; 95-97.

4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - С. 120–126; 129; 139-143; 159–162.

Теоретичні питання

1. Ферменти як біологічні каталізатори реакцій обміну речовин; власти­­­вості білків-ферментів.

2. Номенклатура ферментів та їх класифікація за типом реакції.

3. Будова фермент­­­них білків; олігомерні білки-ферменти; мультиензимні комплекси, мебранно-асоційовані ферменти та мультиензимні комплекси.

4. Кофактори та коферменти. Будова і властивості кофермен­­­тів; вітаміни як попередники в біосинтезі кофермен­­­тів.

5. Найбільш поширені коферменти: похідні вітаміну В₁, В₂, В₃, В₅, В₆, В_с, В₁₂, Н та похідні ліпоєвої кислоти.

6. Класифікація коферментів за хімічною природою, типом реакції, яку вони каталі­­­зують.

7. Складні білки-ферменти; проcтетичні групи складних білків-ферментів.

8. Методи виділення ферментів з біооб'єктів, їх фракціонування (ультрацентрифугування, гель- та іонообмінна хроматографія, афінна хроматографія, електрофорез) і аналіз активності ферментів.

 

На занятті ви повинні будете виконати експериментальну частину роботи згідно з алгоритмом лабораторної роботи та методикою її проведення.

Алгоритм лабораторної роботи 1

1 Збирають 2-3 мл слини.

2 Отримують розведену і прокип’ячену слину (у відповідності до методики експерименту).

3 Готують 3 пробірки, маркують їх, вносять в кожну пробірку субстрат і фермент амілазу, який міститься в слині (відповідно до методики).

4 Інкубують протягом 10 хв. у термостаті при t⁰=38⁰С.

5 Після інкубації вміст кожної пробірки ділять на дві рівні частини - всього 6 пробірок.

6 В 3 пробірках проводять якісну реакцію на продукти гідролізу крохмалю.

Методика проведення експерименту

Визначення термолабільності амілази слини

 

Термолабільність амілази

Принцип методу: про залежність активності амілази слини від температури свідчить розщеплення цим ферментом крохмалю в різних температурних умовах. Ступінь розщеплення крохмалю визначають за реакцією з йодом або реакцією Тромера.

Хід роботи: у чисту пробірку збирають 2-3 мл слини. З неї відбирають 4 краплі слини і додають 16 крапель води (слина розводиться у 5 разів).

Решту слини кип’ятять 5 хв. на відкритому вогні, після чого охолоджують. Потім беруть 3 пробірки, у кожну з яких наливають по 10 крапель 1% розчину крохмалю. В 1-шу пробірку додають 10 крапель розведеної в 5 разів слини, у 2-гу – 10 крапель прокип’яченої слини, у 3-тю – 10 крапель води як контроль. Всі пробірки ставлять у термостат на 10 хв. при 38⁰С. Вміст усіх пробірок ділять на 2 частини і проводять якісні реакції на крохмаль і продукти його гідролізу – глюкозу і мальтозу (всього 6 пробірок).

 

1.1 Реакція на крохмаль (йодна проба)

У три пробірки вливають по 1 краплі розчину Люголя (йод у йодиді калію). За наявності крохмалю з’являється синє забарвлення.

 

Реакція Тромера

У три пробірки вливають 5 крапель 10% розчину гідроокису натрію і додають 3 краплі 1% розчину сульфату міді. Обережно нагрівають пробірки до кипіння і кип’ятять 1 хв на відкритому вогні. Поява червоного забарвлення свідчить про позитивну реакцію Тромера за наявності мальтози і глюкози. Отримані результати записують у таблицю і роблять висновки.

 

Номер пробірки	Фермент	Субстрат	Темпе-ратура	Йодна проба	Реакція Тромера

Алгоритм лабораторної роботи 2

1 Готують 3 пробірки, маркують їх.

2 Збирають слину і розводять її у 5 разів.

3 У пробірки з різними субстратами (1 - крохмаль, 2 - сахароза) вносять фермент.

4 Інкубують пробірки 10 хв. у термостаті при t⁰ = 38⁰C.

5 Після інкубації проводять якісну реакцію на продукти гідролізу крохмалю.

 

Методика проведення експерименту

Визначення специфічності амілази слини

Принцип методу: амілаза розщеплює крохмаль і не діє на сахарозу. Гідроліз крохмалю визначається позитивним результатом реакції Тромера.

Хід роботи: у 2 пробірки наливають по 5 крапель слини, розведеної у 5 разів. У 1-шу пробірку додають 10 крапель 1% розчину крохмалю, у 2-гу – 10 крапель 1% розчину сахарози. Обидві пробірки ставлять у термостат при 38⁰С на 10 хв. Після цього з вмістом пробірок проводять реакцію Тромера. Результати записують у таблицю і роблять висновки.

Номер пробірки	Фермент	Субстрат	Результат реакції Тромера

Алгоритм лабораторної роботи 3

1 Готують 2 пробірки, маркують їх.

2 Збирають слину.

3 Заповнюють пробірки реактивами (у відповідності до методики експерименту), створюючи розчини з різними значеннями рН, куди вміщують субстрат і фермент.

4 Інкубують пробірки 15 хв. у термостаті при t⁰ = 38⁰C.

5 Після інкубації із вмістом пробірок проводять якісну реакцію на крохмаль.

 

Методика проведення експерименту