Тема 2. 7. Ингибиторы активности ферментов

1. Под термином «ингибирование активности ферментов» понимают специфическое снижение каталитической активности, вызванное определенными химическими веществами - ингибиторами.

Ингибиторы представляют большой интерес для выяснения механизмов ферментативного катализа, помогают установить роль отдельных ферментативных реакций в метаболических путях организма. В основе действия многих лекарственных препаратов и ядов лежит принцип ингибирования ферментативной активности.

2. Ингибиторы способны связываться с ферментами с разной степенью прочности. На основании этого различают обратимое и необратимое ингибирование. Обратимые ингибиторы связываются с ферментом слабыми нековалентными связями и при определенных условиях легко отделяются от фермента:

Е + I ↔ EI.

Необратимое ингибирование наблюдается в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента:

Е + I → E-I.

3. По механизму действия обратимые ингибиторы подразделяются на конкурентные и неконкурентные.

Конкурентное ингибирование вызывает обратимое снижение скорости ферментативной реакции в результате связывания ингибитора с активным центром фермента, которое препятствует образованию ферментсубстратного комплекса. Такой тип ингибирования наблюдается, когда ингибитор является структурным аналогом субстрата; в результате возникает конкуренция молекул субстрата и ингибитора за связывание с активным центром фермента. В этом случае с ферментом взаимодействует либо субстрат, либо ингибитор, образуя комплексы фермент-субстрат (ES) или фермент-ингибитор (EI). При формировании комплекса фермента и ингибитора (EI) продукт реакции не образуется (рис. 2.19).

Рис. 2.19. Схема конкурентного ингибирования активности фермента

Для конкурентного типа ингибирования справедливы следующие уравнения:

E + S ↔ ES → E + P; E + I ↔ EI.

Отличительной особенностью конкурентного ингибирования является возможность его ослабления при повышении концентрации субстрата, так как обратимый ингибитор не изменяет структуры фермента. Поэтому при высоких концентрациях субстрата скорость реакции не отличается от таковой в отсутствие ингибитора, т.е. конкурентный ингибитор не изменяет V_max, но повышает K_m.

Классическим примером конкурентного ингибирования является ингибирование сукцинатдегидрогеназной реакции малоновой кислотой (рис. 2.20). Малонат является структурным аналогом сукцината (наличие двух карбоксильных групп) и может также взаимодействовать с активным центром сукцинатдегидрогеназы. Однако перенос двух атомов водорода на простетическую группу FAD от малоновой кислоты невозможен и, следовательно, скорость реакции снижается.

Рис. 2.20. Пример конкурентного ингибирования сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой:

А - сукцинат связывается с активным центром фермента сукцинатдегидрогеназы за счет ионных связей; Б - в ходе ферментативной реакции происходит отщепление двух атомов водорода от сукцината с присоединением их к коферменту FAD. В результате образуется фумарат, который удаляется из активного центра сукцинатдегидрогеназы; В - малонат является структурным аналогом сукцината, он также связывается с активным центром сукцинатдегидрогеназы, но химическая реакция не идет

4. Многие лекарственные препараты оказывают свое терапевтическое действие по механизму конкурентного ингибирования. Например, реакция гидролиза ацетилхолина на холин и уксусную кислоту катализируется ферментом ацетилхолинэстеразой (АХЭ) (рис. 2.21) и может быть ингибирована в присутствии конкурентных ингибиторов этого фермента (например, прозерин, эндрофоний и др.) (рис. 2.22). При добавлении таких ингибиторов активность ацетилхолинэстеразы уменьшается, концентрация ацетилхолина (субстрата) увеличивается, что сопровождается усилением проведения нервного импульса. Конкурентные ингибиторы ацетилхолин-эстеразы используются при лечении мышечных дистрофий, а также для лечения двигательных нарушений после травм, параличей, полиомиелита.

Рис. 2.21. Реакция гидролиза ацетилхолина под действием АХЭ

Рис. 2.22. Связывание в активном центре АХЭ конкурентных ингибиторов

А - присоединение субстрата (ацетилхолина) в активном центре фермента.

Стрелкой указано место гидролиза ацетилхолина; Б - присоединение конкурентного ингибитора прозерина в активный центр фермента. Реакция не идет; В - присоединение конкурентного ингибитора эндрофония в активный центр фермента. Присоединение ингибиторов к активному центру АХЭ препятствует присоединению ацетилхолина

Другой пример лекарственных препаратов, механизм действия которых основан на конкурентном ингибировании фермента, - использование при заболеваниях поджелудочной железы (острые панкреатиты, некрозы) пептидных ингибиторов протеолитического фермента трипсина, таких как апротинин, трасилол, контрикал. Эти лекарственные препараты ингибируют трипсин, который высвобождается в окружающие ткани и кровь, и тем самым предотвращают нежелательные аутолитические явления при заболеваниях поджелудочной железы.

5. В некоторых случаях конкурентные ингибиторы, взаимодействуя с активным центром фермента, могут использоваться ими в качестве псевдосубстратов (антиметаболитов), что приводит к синтезу продукта с неправильной структурой. Полученные вещества не имеют «нужную» структуры и поэтому лишены функциональной активности. К таким лекарственным веществам относятся сульфаниламидные препараты.

6. Неконкурентным обратимым называют такое ингибирование ферментативной реакции, при котором ингибитор взаимодействует с ферментом в участке, отличном от активного центра. Неконкурентные ингибиторы не являются структурными аналогами субстрата; присоединение неконкурентного ингибитора к ферменту изменяет конформацию активного центра и уменьшает скорость ферментативной реакции, т.е. снижает ферментативную активность. Примером неконкурентного ингибитора может быть действие ионов тяжелых металлов, которые взаимодействуют с функциональными группами молекулы фермента, препятствуя катализу.

7. Необратимые ингибиторы снижают ферментативную активность в результате образования ковалентных связей с молекулой фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента. В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.

Использование необратимых ингибиторов представляет больший интерес для выяснения механизма действия ферментов. Важную информацию о структуре активного центре фермента дают соединения, блокирующие определенные группы активного центра. Такие ингибиторы называют специфическими. К специфическим ингибиторам причисляют диизопропилфторфосфат (ДФФ). ДФФ образует ковалентную связь с ОН-группой серина, содержащемся в активном центре фермента и принимающем непосредственное участие в катализе, поэтому ДФФ относят к специфическим необратимым ингибиторам «сериновых» ферментов (рис. 2.23). ДФФ используют с целью изучения структуры активного центра ферментов в энзимологии.

В отличие от специфических ингибиторов неспецифические ингибиторы образуют ковалентные связи с определенными группами фермента, расположенными не только в активном центре, но и в любом участке молекулы фермента. Например, ацетат йода (рис. 2.24) взаимодействует с любыми SH-группами белка. Такое взаимодействие изменяет конформацию молекулы фермента, а соответственно, и конформацию активного центра и снижает каталитическую активность.

Рис. 2.23. Специфическое ингибирование активности химотрипсина с помощью ДФФ

Рис. 2.24. Неспецифическое ингибирование активности фермента ацетатом йода.

Неспецифическое ингибирование происходит вследствие ковалентной модификации SH-групп цистеина молекулами ацетата йода

8. Примером лекарственного препарата, действие которого связано с необратимым ингибированием ферментов, является широко используемый аспирин. Действие этого противовоспалительного нестероидного препарата основано на ингибировании фермента циклооксигеназы, катализирующего реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате ацетильный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой ОН-группе серина одной из субъединиц циклооксигеназы (рис. 2.25). Тем самым блокируется образование простагландинов (см. модуль 8), которые обладают широким спектром биологических функций и в том числе являются медиаторами воспаления. Поэтому аспирин относят к противовоспалительным средствам. Ингибированные молекулы фермента разрушаются, синтез простагландинов восстанавливается только после синтеза новых молекул фермента.

Рис. 2.25. Механизм инактивации циклооксигеназы с помощью необратимого ингибитора - аспирина