А. И. Грицук, В. Т. свергун, А. Н. Коваль 


Мы поможем в написании ваших работ!



ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

А. И. Грицук, В. Т. свергун, А. Н. Коваль



Министерство здравоохранения Республики Беларусь

Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет»

Кафедра биохимии

А. И. Грицук, В. Т. свергун, А. Н. Коваль

БИОХИМИЯ

Практикум

Темы занятий

занятие 1 Вводное занятие. Современные биохимические методы исследования

Занятие 2 Строение и функции белков

занятие 3 Ферменты-1. Строение и функции белков.
Строение, свойства, номенклатура и классификация ферментов.

занятие 4 Ферменты-2. Механизм действия ферментов

занятие 5 Ферменты-3. Медицинская энзимология

ЗАНЯТИЕ 6 Биологическое окисление-1. Цикл Кребса. Пути потребления кислорода в организме.

занятие 7 Биологическое окисление-2. Тканевое дыхание.
Окислительное фосфорилирование. Микросомальное и перекисное окисление.

занятие 8 Контрольное занятие по разделам «Введение в биохимию», «Энзимология и биологическое окисление».

Гомель 2013

Раздел 1 Введение в биохимию

Занятие 1

Вводное занятие. Современные биохимические методы исследования

Цель занятия: знакомство с правилами внутреннего распорядка на кафедре биохимии, с правилами работы в химической лаборатории и правилами техники безопасности. Знакомство основными методами биохимических исследований.

 

Структура занятия

Теоретическая часть

1.1 Ознакомление с правилами внутреннего распорядка на кафедре биохимии и правилами работы в химической лаборатории. Проведение инструктажа по технике безопасности. Знакомство со структурой курса биохимии.

1.2 Биохимия как фундаментальная медико-биологическая наука. Значение биохимии в подготовке врача.

1.3 Характеристика основных биохимических методов, используемых в эксперименте и клинике:

а) на уровне целого организма:

- наблюдение за организмом:

o при удалении органа;

o изменении диеты (голодание или усиленное питание);

o приеме лекарств;

o введении специфических ядов и токсинов;

- наблюдения за человеком и животными со специфическими заболеваниями;

- использование ЯМР-спектроскопии и др.;

б) перфузия изолированного органа;

в) использование тканевых срезов;

г) использование целых клеток;

д) использование гомогенатов;

е) выделение изолированных клеточных органелл;

ж) метод субфракционирования клеточных органелл;

з) выделение метаболитов и ферментов;

и) клонирование генов, кодирующих ферменты и другие белки.

Практическая часть

2.1 Применение Международной системы единиц (СИ) в международной лабораторной практике.

2.2 Особенности работы в биохимической лаборатории.

2.3 Инструктаж по технике безопасности.

2.4 Устройства и приборы, применяемые в биохимической лаборатории. Правила работы с ними.

 

Задачи

1 Согласно термина «биохимия», в живых организмах изучается:

а) переход количества в качество;

б) взаимодействие живых организмов с веществом;

в) превращения вещества и энергии;

г) количественный состав;

д) качественный состав?

(ответ: г, д)

2 Для изучения остаточного азота в плазме крови необходимо избавиться от белков, осаждением их трихлоруксусной кислотой. К какому этапу исследования относится эта процедура?

а) выделение изолированных клеточных органелл;

б) метод субфракционирования клеточных органелл;

в) выделение метаболитов и ферментов;

г) клонирование генов, кодирующих ферменты и другие белки.

(ответ: в)

3 Катаболизм белков сопровождается синтезом в печени мочевины CO(NH2)2. Среднее содержание азота в белке 16%. Какое количество мочевины (моль) может образоваться при катаболизме 175 г белка?

(ответ: 175*0,16/14/2=1 моль)

4 Большинство биохимических показателей концентрации веществ выражается в единицах СИ моль/л. Почему для концентрации белка в сыворотке крови (65-85 г/л) не используются эти единицы?

(ответ: из-за гетерогенности белков сыворотки крови)

 

Лабораторные работы

Лаборатоpная работа. Устройства и приборы, применяемые в биохимической лаборатории. Правила работы с ними.

Студенты под руководством преподавателя знакомятся с проведением исследований в биохимической лаборатории, а также с правилами пользования пипетками, центрифугой, термостатом, фотоэлектроколориметром и рефрактометром.

Работа с микропипетками включает ряд навыков и умений: сменять наконечник, правильно использовать 2 упора хода поршня (первый упор – для точного отмеривания заданного количества, второй упор – для внесения образца в пробирку или колбу). Перед внесением пробы убедиться, что в отобранном образце нет пузырьков воздуха. В пипетках с вариабельным объемом требуемый объем устанавливается путем вращения лимба с цифровым индикатором.

 

Рекомендуемая литература

Основная

1 Биохимия: Учебник для вузов / Под ред. Е.С. Северина. – 4-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 69-73.

2 Филиппович, Ю. Б. Основы биохимии. – 4-е изд. – М.: Агар, 1999. – С. 15-22.

3 Марри, Р. и др. Биохимия человека: в 2-х т.: Пер. с англ., М.: Мир, 2004. – Т.1: С. 16-20.

 

Занятие 2

Строение и функции белков

Цель занятия: Изучить структуру и физико-химические свойства белков. Научиться определять содержание общего белка в плазме крови биуретовым методом.

 

Структура занятия

Теоретическая часть

1.1 Введение в биохимию. Краткая история биохимии. История отечественной биохимии. Общая характеристика обмена веществ. Понятие об анаболизме, катаболизме и метаболизме.

1.2 Белки – важнейшие компоненты организма. Функции белков, строение, классификация и свойства аминокислот. Обзор уровней структурной организации белковой молекулы. Молекулярная масса белков. Форма и размеры белковой молекулы.

1.3 Принципы определения структуры белка:

1.3.1 Кислотный гидролиз белка;

1.3.1.1 Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографии;

1.3.1.2 Количественный анализ полученных фракций;

1.3.2 Определение аминокислотной последовательности в белках и олигопептидах;

1.3.2.1 Ферментативное расщепление пептидов (пепсином, трипсином, химотрипсином, папаином);

1.3.2.2 Химическое расщепление пептидов (бромцианом);

1.3.2.3 Определение С-концевых аминокислот (карбоксипептидазами);

1.3.2.4 Определение N-концевых аминокислот (дансил-хлоридом, динитрофторбензолом, фенилизотиоцианатом);

1.3.2.5 определение первичной структуры белка (аминокислотной последовательности);

1.3.2.6 методы пептидных карт («метод отпечатков пальцев»).

1.3.3 Изучение пространственной структуры белковой молекулы (вторичная, третичная, четвертичная структуры):

1.3.3.1 Рентгеноструктурный анализ.

1.3.3.2 Изучение трехмерных моделей белка (Protein Data Bank).

1.3.4 Представление о нативно-развернутых белках – функционально-активной форме белков в клетке.

 

Практическая часть

2.1 Решение задач.

2.2 Лабораторные работы.

2.3 Проведение контроля конечного уровня знаний.

 

Задачи

1 Рассмотрите указанные группы аминокислот и отметьте, какие из них являются гидрофобными:

а) тир, асп, глу; б) ала, лиз, сер; в) иле, лей, лиз; г) вал, лей, ала; д) арг, гли, цис?

2 Многие белки, содержащие 2 и более доменов, обнаруживают гомологию аминокислот. Эти белки образуются путем:

а) посттрансляционной модификации (процессинга); б) генетических изменений; в) дупликации генов и их слияния; г) аллостерической кооперации; д) транспептидных образований.

3 Остатки каких аминокислот в белках-гликопротеидах ковалентно связывают углеводы? Напишите пентапептид с этими аминокислотами (-ала- X -трп- Y -гли), где X и Y – названные аминокислоты.

4 Остатки каких аминокислот в белках-гистонах обладают положительным зарядом? Напишите пентапептид с этими аминокислотами (-ала- X -мет- Y -гли), где X и Y ‑ названные аминокислоты.

5 К фибриллярным белкам относятся:

а) альбумины; б) гистоны; в) коллагены; г) глобулины.

Лабораторные работы

Лабораторная работа. Количественное определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом (УИРС)

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с раствором гидроксида натрия.

Принцип метода. В щелочной среде пептидные связи белка образуют с ионами двухвалентной меди комплекс фиолетового цвета (см. уравнение). Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка, определяемой фотометрически.

Ход работы. В пробирку наливают 0,05 мл сыворотки крови, затем добавляют 2,5 мл биуретового реактива. Содержимое пробирки осторожно перемешивают, избегая пенообразования, и через 30 мин фотометрируют в кюветах 5 мм при 540 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора (дистиллированная вода). Измерив экстинкцию исследуемого раствора, по калибровочной кривой определяют концентрацию белка.

Клинико-диагностическое значение. Нормальное содержание белка в сыворотке крови у взрослых людей – 65–85 г/л, у детей – 58–85 г/л.

Повышенное содержание белка в сыворотке крови (гиперпротеинемия) встречается сравнительно редко. Прежде всего, при сгущении крови из-за значительных потерь внеклеточной жидкости, например, при усиленном потоотделении, неукротимой рвоте, профузных поносах (диареи), несахарном диабете, холере, обширных ожогах. Кратковременная относительная гиперпротеинемия отмечается также при ревматизме и миеломной болезни.

Снижение уровня белка в крови (гипопротеинемия) наблюдается при длительном голодании, нефритах, злокачественных опухолях, тяжелых гнойных процессах, обширных ожогах и др.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

_

_

_

_

Рекомендуемая литература

Основная

1 Кухта, В.К и др. Биологическая химия: учебник / В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович; под ред. А.Д. Тагановича. – Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. – С. 3-4, 7-40.

2 Биохимия: Учебник для вузов / Под ред. Е.С. Северина. – 4-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 9-69.

3 Филиппович, Ю. Б. Основы биохимии. – 4-е изд. – М.: Агар, 1999. – С. 5-14, 23-78.

4 Николаев, А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 24-60.

5 Марри, Р. и др. Биохимия человека: в 2-х т.: Пер. с англ., М.: Мир, 2004. – Т.1: С. 16-19, 42-51.

6 Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – С. 19-77.

Дополнительная

7 Ленинджер, А. Л. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 1. С. 107–225.

8 Тюкавкина Н. А., Бауков Ю. И. Биоорганическая химия. М.: Медицина, 1991. С. 313–376.

9 Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки, М.: Мир, 1994. Т. 1. С. 113–171.

Раздел 2 Энзимология и биологическое окисление

Занятие 3

Ферменты-1. Строение и функции белков.
Строение, свойства, номенклатура и классификация ферментов.

 

Цель занятия: закрепить знания по структуре белков, сформировать представления о строении и свойствах, номенклатуре и классификации ферментов. Научиться выполнять качественные реакции на аминокислоты и пептиды.

 

Структура занятия

1 Теоретическая часть

1.1 Понятие о ферментах. История энзимологии. Особенности ферментативного катализа. Строение ферментов. Доказательства белковой природы ферментов.

1.2 Характеристика уровней структурной организации белковой молекулы (первичная, вторичная, третичная, четвертичная структуры) и связей, удерживающих ее. Высаливание, денатурация, причины, признаки и механизм.

1.3 Кофакторы ферментов: ионы металлов и коферменты. Участие витаминов в построении коферментов. Роль микроэлементов в ферментативном катализе (Fe, Cu, Co, I, Mg, Zn, Mn, F, Se).

1.4 Структурно-функциональная организация ферментов: активный (субстратный) центр, каталитический, аллостерический участки.

1.5 Локализация ферментов в клетке (клеточная мембрана, цитоплазма, митохондрии, ядро, лизосома, рибосомы). Маркерныеферменты. Органно­специфические ферменты. Выделение и очисткаферментов.

1.6 Качественное обнаружение иколичественноеопределение.Единицы измерения количества и активности ферментов.

1.7 Номенклатура и классификация ферментов.

Практическая часть

2.1 Решение задач.

2.2 Лабораторные работы.

2.3 Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1. Напишите формулу пептида Глу-Тир-Про-Гис-Сер. Какие из перечисленных цветных реакций будут положительными с данным пептидом:

а) биуретовая, б) Фоля, в) ксантопротеиновая, г) Милона?

2. О чем свидетельствуют цветные реакции на белки:

а) о наличии белка в биологической жидкости;

б) о первичной структуре белка;

в) о конформации белка;

г) о наличии некоторых аминокислот в структуре белка;

д) о функции белка;

е) о наличии числа уровней структурной организации?

3. Зимогены превращаются в ферменты путем реакций:

а) аденилирования; б) фосфорилирования; в) метилирования; г) ограниченного протеолиза?

4. Активный центр фермента:

а) содержит каталитические и вспомогательные аминокислоты;

б) создает благоприятное окружение для взаимодействия фермента и субстрата;

в) является основным в формировании свойств третичной структуры фермента;

г) может содержать дополнительные сайты небелкового строения, необходимые для каталитического действия;

д) обязательно содержит SH-группы?

5. Простетическая группа фермента представляет собой:

а) альфа-спираль молекулы фермента; б) апофермент; г) небелковую часть фермента; д) холофермент; е) аллостерический центр фермента?

6. Функция якорного участка фермента:

а) превращение субстрата; б) связывание субстрата; г) временное связывание регулятора с последующим отщеплением; д) поддержание конформации активного центра?

7. Катал – это единица, отражающая:

а) активность фермента; б) константу Михаэлиса-Ментен; г) концентрацию фермента; д) концентрацию ингибитора; е) коэффициент молекулярного погашения?

8. Активность фермента, выраженная в каталах, имеет размерность:

а) моль/мин; б) моль/с; в) мкмоль/с; г) мкмоль/мин; д) моль/час?

9. Ферменты разделяются на 6 классов в соответствии с:

а) типом катализируемой реакции; б) структурой; в) субстратной специфичностью; г) активностью; д) органной специфичностью?

Лабораторные работы

Лабораторная работа № 1. Цветные реакции на белки и аминокислоты

Биуретовая реакция.

Принцип метода. см. в занятии «Строение и функции белков».

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с гидроксидом натрия.

Ход работы. В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 10 %-го раствора гидроксида натрия и по 1 капле 1 %-го раствора медного купороса. Во всех пробирках наблюдают устойчивое сине-фиолетовое окрашивание.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Нингидриновая реакция.

Принцип метода. Основан на образовании димера нингидрина и азота аминогруппы сине-фиолетового цвета (комплекс Руэмана ‑ см. уравнение).

Ход работы. К 5 каплям раствора белка прибавить 5 капель раствора нингидрина и прокипятить 1–2 мин. Появляется сине-фиолетовое окрашивание.

 

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

 

Ксантопротеиновая реакция (Мульдера).

Принцип метода. Основан на образовании нитросоединений ароматических и гетероциклических аминокислот, окрашенных в ярко-желтый цвет (см. уравнение).

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с концентрированной азотной кислотой.

 

Ход работы. В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно кипятят. В первой пробирке образуется осадок желтого цвета, а во второй – слабое окрашивание, т. к. желатин не содержит циклических аминокислот. В 3‑й пробирке образуется осадок белого цвета, переходящий в желтый цвет. Пробирки охлаждают и добавляют в каждую по 10–15 капель 20 %-го едкого натра до изменения окраски растворов вследствие образования натриевой соли динитротирозина.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

 

Реакция на тирозин (Миллона).

Принцип метода. Основан на образовании осадка ртутной соли динитротирозина кроваво-красного цвета (см. уравнение).

 

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с реактивом Миллона (содержит Hg и HNO3).

Ход работы. В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 3 капли реактива Миллона (раствор ртути в азотной кислоте) и осторожно нагревают. Отмечают изменение цвета в пробирках, характеризующее наличие в указанных белках тирозина.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Реакция Фоля (на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу).

Принцип метода. Основан на щелочном гидролизе сульфгидрильных групп SH белка с последующим отщеплении серы в виде сульфида свинца (PbS) черно-бурого цвета (см. уравнение).

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с реактивом Фоля (содержит NaOH и Na2PbO2).

 

Ход работы. В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель реактива Фоля. Затем интенсивно кипятят и дают постоять 1–2 мин. При этом в 1-й и в 3-й пробирках образуется черный или бурый осадок сульфида свинца. Желатин осадка не образует, т. к. в нем нет серосодержащих аминокислот.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

 

Лабораторная работа № 2. Реакции осаждения белков

Осаждение белков при кипячении.

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с нагреванием пробирок.

 

Ход работы. В 5 пробирок наливают по 5 капель раствора белка. Первую пробирку нагреть до кипения. Жидкость мутнеет, т. к. разрушаются водные оболочки вокруг молекулы белка, и происходит укрупнение его частиц. Мицеллы белка несут заряд и удерживаются во взвешенном состоянии.

Во 2-й пробирке нагреть раствор до кипения и добавить 2 капли 1 %-го раствора уксусной кислоты до слабого подкисления. При отстаивании выпадает осадок белка. Частицы белка теряют заряд и приближаются к изоэлектрическому состоянию.

В 3-ю пробирку добавить 5 капель уксусной кислоты для сильнокислой реакции среды. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость.

В 4-ю пробирку налить 5 капель раствора уксусной кислоты, 2 капли насыщенного раствора хлористого натрия и нагреть. Выпадает белый хлопьевидный осадок, т. е. частицы белка теряют заряд.

В 5-ю пробирку добавить 2 капли раствора гидроксида натрия. При кипячении осадок не образуется, т. к. в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

 

Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с концентрированными азотной и серной кислотами.

Ход работы. В 2 пробирки наливают по 10 капель концентрированных кислот: азотной и серной. Наклонив пробирки под углом 45 градусов, осторожно по стенке пробирки приливают равный объем раствора белка так, чтобы обе жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца. При добавлении избытка азотной кислоты осадок не исчезает, а при добавлении серной кислоты осадок растворяется.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

 

Осаждение белков органическими растворителями.

Ход работы. В 2 пробирки вносят по 5 капель раствора белка и прибавляют по 15–20 капель этилового спирта и ацетона.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

 

Осаждение белков органическими кислотами.

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с трихлоруксусной кислотой.

Ход работы. В две пробирки наливают по 5 капель раствора белка и добавляют по 2 капли раствора ТХУ (трихлоруксусной кислоты) в одну и 2 капли сульфосалициловой – в другую. Следят за изменением растворов.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_

_

_

Лабораторная работа № 3. Разделение альбуминов и глобулинов методом высаливания (УИРС)

Принцип метода. Основан на обратимой реакции осаждения белков из растворов с помощью высоких концентраций нейтральных солей (NaCl, NH4Cl, MgSO4 и др.).

Ход работы. К 1 мл неразведенного яичного белка добавляют 1 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сульфата аммония, в котором выпадает осадок яичного глобулина. Через 5 мин осадок отфильтровывают, в фильтрате остается яичный альбумин. Для высаливания альбуминов к фильтрату добавляют порошок сульфата аммония до полного насыщения, т. е. пока новая порция порошка остается нерастворенной. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают. С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белка.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_

_

Рекомендуемая литература

Основная

1 Кухта, В.К и др. Биологическая химия: учебник / В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович; под ред. А.Д. Тагановича. – Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. – С. 45-46, 54-60.

2 Биохимия: Учебник для вузов / Под ред. Е.С. Северина. – 4-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 9-73, 75-80, 83-92.

3 Филиппович, Ю. Б. Основы биохимии. – 4-е изд. – М.: Агар, 1999. – С. 49-78, 95-105.

4 Николаев, А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 61-63, 68-78.

5 Марри Р. и др. Биохимия человека: в 2-х т.: Пер. с англ., М.: Мир, 2004. – Т.1: С. 47-51, 63-66, 79-81.

Дополнительная

6 Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – С. 114-143.

7 Ленинджер, А. Л. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 1. С. 226–302.

8 Тюкавкина Н. А., Бауков Ю. И. Биоорганическая химия, М.: Медицина, 1991. С. 313–376.

9 Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 1. С. 113–171.

 

 

Занятие 4

Ферменты-2. Механизм действия ферментов

Цель занятия: закрепить знания по структуре ферментов, сформировать представления о механизме действия ферментов. Научиться выполнять качественные реакции на активность некоторых гидролитических ферментов.

 

Структура занятия

Теоретическая часть

1.1 Свойства ферментов (термолабильность, специфичность и др.). Механизм действия ферментов. Этапы взаимодействия фермента и субстрата. Гипотезы Э. Фишера, Д. Кошланда и современные взгляды.

1.2 Теория промежуточных соединений. Основы термодинамики катализа. Энергия активации. Энергетический барьер.

1.3 Кинетика ферментативных реакций (факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций: природа фермента и субстрата, их концентрация, pH, температура, лекарственные препараты и др.). Константа Михаэлиса (Km) – определение, физическое значение.

1.4 Регуляция активности ферментов. Роль гормонов, цАМФ, активаторов, ингибиторов.

1.4.1 Регуляция активности путем химической модификации ферментов (ограниченный протеолиз, фосфорилирование, метилирование и др.).

1.5 Виды ингибирования.

1.6 Аллостерическая регуляция. Свойства аллостерических ферментов.

Практическая часть

2.1 Решение задач и проведение контроля конечного уровня знаний.

2.2 Лабораторные работы.

 

Задачи

1 При увеличении концентрации субстрата скорость ферментативной реакции...

а) сначала возрастает, затем падает;

б) не изменяется;

в) сначала возрастает, затем стабилизируется на постоянном уровне;

г) непрерывно возрастает пропорционально концентрации субстрата;

д) сначала убывает, затем возрастает?

2 Температурный оптимум для большинства ферментов находится в диапазоне:

а) от 36 до 38°C; б) от 40 до 44°C; в) от 30 до 34°C; г) от 0 до 8°C?

3 Энергия активации – это…

а) энергия, необходимая для перевода всех молекул фермента в активированное состояние;

б) энергия, необходимая для перевода всех молекул субстрата в активированное состояние;

в) разница величин энергий субстратов и продуктов реакции;

г) общая энергия системы?

4 Взаимодействие, описываемое выражением «как рука к перчатке»:

а) субстрат + активный центр;

б) ингибитор + активный центр;

в) регулятор + аллостерический центр;

г) якорная площадка + каталитическая площадка?

5 Активность ЛДГ при увеличении температуры с 30 до 40°C:

а) не изменится; б) станет равной нулю; в) уменьшится в 2-4 раза; г) увеличится в 2-4 раза; д) возрастет в 10 раз?

6 Активность АсАТ при постепенном изменении температуры с 30 до 70°C:

а) сначала увеличится, затем резко снизится; б) не изменится; в) увеличится в среднем в 32 раза; г) немедленно упадет до нуля; д) будет постепенно нарастать?

7 Константа Михаэлиса – это…

а) молярный коэффициент экстинкции фермента;

б) коэффициент, отражающий зависимость скорости реакции от температуры;

в) концентрация субстрата, при которой достигается максимальная скорость реакции;

г) концентрация субстрата, при которой скорость ферментативной реакции составляет половину максимальной?

8. Величина константы Михаэлиса отражает:

а) сродство фермента к субстрату;

б) зависимость скорости реакции от концентрации фермента;

в) зависимость скорости реакции от температуры;

г) сродство фермента к ингибитору;

д) эффекты коферментов и ингибиторов?

 

Лабораторные работы

Лаборатоpная работа № 1. Изучение действия ферментов

Действие липазы.

Липаза входит в состав сока поджелудочной железы. В желудочном соке она содержится в небольшом количестве и действует только на предварительно эмульгированные жиры. В кишечнике желчные кислоты и белки способствуют эмульгированию липидов. Действие липазы можно обнаружить, добавив ее раствор к молоку, предварительно слабо подщелоченному раствором карбоната натрия в присутствии фенолфталеина, дающего бледно-розовую окраску.

Принцип метода. Липаза ускоряет гидролиз нейтрального жира на глицерин и жирные кислоты (см. уравнение), что приводит к снижению pH и исчезновению розовой окраски индикатора – фенолфталеина.

Ход работы. В две пробирки наливают по 10 капель молока. В 1-ю пробирку добавляют 5 капель панкреатина, содержащего липазу, во 2-ю – 5 капель воды. В обе пробирки наливают по 1 капле 0,5 %-го раствора фенолфталеина и по каплям 1 %-го раствора карбоната натрия до появления бледно-розовой окраски при pH 8,0 (нельзя приливать избыток раствора карбоната натрия). Пробирки помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. Наблюдают обесцвечивание раствора в пробирке, содержащей липазу.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Действие уреазы.

Принцип метода. Уреаза катализирует гидролиз мочевины на двуокись углерода и аммиак (см. уравнение), что приводит к увеличению pH, которое регистрируется индикатором – фенолфталеином.

Ход работы. Берут две пробирки. В 1-ю отмеривают 1мл 1 %-го раствора мочевины, а во 2-ю ‑ 1мл 1 %-го раствора тиомочевины. В каждую пробирку добавляют по 2 капли фенолфталеина и по 1 мл раствора уреазы. Содержимое обеих пробирок встряхивают, оставляют на несколько минут при комнатной температуре и наблюдают за появлением розовой окраски в пробирке с мочевиной и отсутствием окраски в пробирке с тиомочевиной. Содержимое 1-й пробирки приобретает розовую окраску вследствие смещения pH раствора в щелочную сторону за счет образования аммиака.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

Лаборатоpная работа № 2. Изучение влияния различных факторов на скорость ферментативных реакций (УИРС).

Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы.

Ход работы.

1 В одну пробирку вносят 10 капель дистиллированной воды, а во 2-ю – 8 капель воды и 2 капли 1 %-го раствора хлорида натрия, в 3-ю – 8 капель воды и 2 капли раствора сульфата меди.

2 В каждую пробирку добавляют по 20 капель разведенной слюны (1: 10), пробирки перемешивают, добавляют по 5 капель раствора крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре 5 мин.

3 Тем временем готовят 3 пробирки с водой (по 1 мл), подкрашенной каплей раствора йода, и добавляют в них по 3 капли содержимого опытных проб. Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления крахмала амилазой. В 1-й пробирке появляется фиолетовая или красно-бурая окраска, во 2-й пробирке, где ионы хлора играют роль активатора, появляется желтая окраска, а в 3-й, где ионы меди тормозят действие амилазы, – окраска остается синей. Если описанная картина не наблюдается, то опыт повторяют через 10–15 мин.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_

_

Влияние pH на активность амилазы слюны.

Оптимум pH для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях pH среды. О степени расщепления крахмала можно судить по реакции крахмала с йодом в течение времени. При оптимальном значении pH расщепление крахмала произойдет полностью (окраска с йодом отсутствует). По мере удаления от точки pH в кислую или щелочную сторону произойдет лишь частичное расщепление крахмала до стадии декстринов (красно-бурая или фиолетовая окраска) или крахмал вообще расщепляться не будет (синяя окраска).

Ход работы.

1 В 4 пронумерованные пробирки отмеривают отдельными пипетками по 2 мл фосфатного буфера с различным значением pH (6,0; 6;4, 6,8; 7,4).

2 В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала и по 0,5 мл разбавленной (1: 10) слюны, которые помещают в термостат на 10 мин при 38 °С.

3 Из каждой пробирки каплю жидкости смешивают с каплей раствора йода на предметном стекле и сравнивают окрашивание в каждой пробирке. Повторяют эту пробу через 1-2 мин до тех пор, пока проба из 5-й пробирки даст с йодом на стекле красно-бурое окрашивание. Через 1-2 мин после этого во все пробирки добавляют по 2-3 капли раствора йода (начинать с 1-й пробирки). Содержимое пробирок хорошо взбалтывают. Сравнивают между собой окрашивание во всех пробирках и делают вывод о степени расщепления крахмала, а, следовательно, об активности фермента при этом значении pH среды.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_

_

_

Рекомендуемая литература

Основная

1 Кухта, В.К и др. Биологическая химия: учебник / В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович; под ред. А.Д. Тагановича. – Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. – С. 57-82.

2 Биохимия: Учебник для вузов / Под ред. Е.С. Северина. – 4-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 92-118.

3 Филиппович, Ю. Б. Основы биохимии. – 4-е изд. – М.: Агар, 1999. – С. 102-114.

4 Николаев, А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 63-66, 80-97.

5 Марри Р. и др. Биохимия человека: в 2-х т.: Пер. с англ., М.: Мир, 2004. – Т.1: С. 67-68, 76-90, 98-110.

6 Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – С. 143-156.

Дополнительная

7 Ленинджер, А. Л. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 1. С. 226–302.

8 Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 1. С. 113–171.

 

Занятие 5

Ферменты-3. Медицинская энзимология

Цель занятия: сформировать представления об основных аспектах и проблемах медицинской энзимологии. Научиться определять активность амилазы в моче и оценивать ее диагностическую значимость.

Структура занятия

Теоретическая часть

1.1 Изоферменты, их биологическая роль. Полиферментные комплексы. Понятие о метаболоне.

1.2 Изменение активности ферментов в онтогенезе.

1.3 Основные направленияклиническойэнзимологии.

1.3.1 Энзимопатии. Определение. Классификация Степеньклинических проявлений энзимопатий.Первичные (наследственные) энзимопатии. Причины возникновения. Механизм развития первичных и вторичных метаболических нарушений при энзимопатиях.Вторичные (приобретенные) – токсические и алиментарные энзимопатии. Причины возникновения. Механизмразвития метаболических нарушений. Клинические проявления.

1.3.2 Энзимодиагностика, принципы и объекты энзимодиагностики (кровь, моча, слюна, ликвор, пот и др.). Характеристика основных ферментов сыворотки крови (клеточные, секреторные и экскреторные). Типы изменения активности ферментов при патологии (гипо-, гипер- и дисферментемия). Задачи энзимодиагностики.

1.3.3 Энзимотерапия. Использование ферментов для заместительной терапии. Лечение хирургических, сердечно-сосудистых, онкологических и др. заболеваний. Иммобилизованные ферменты. Липосомы, вирусные векторы, ихприменение.

1.3.4 Использование ферментов в лабораторной практике для определения концентрации субстратов и активности ферментов.

1.3.5 Использование ферментов в промышленности и производстве.

Практическая часть

2.1 Решение задач.

2.2 Лабораторная работа.



Поделиться:


Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; просмотров: 284; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 52.90.121.17 (0.212 с.)