Напряму підготовки ,,Біологія” денної форми навчання

 

Затверджено

Вченою радою ЗНУ

Протокол № від 2014 р.

 

 

Запоріжжя

УДКУДК 577.32 (076)

ББК 28.071 я 73

Р 509 М 597

 

Рильський О.Ф., Костюченко Н.І. Біофізика: методичні вказівки до лабораторних робіт для студентів освітньо-кваліфікаційного рівня,,бакалавр” напряму підготовки,,Біологія ” денної форми навчання. – Запоріжжя: ЗНУ, 2014. – 48 с.

 

 

Методичні вказівки містять завдання до лабораторних робіт, які охоплюють основні розділи навчальної програми з біологічної фізики. Коротко описана методика визначення в’язкості біологічних рідин, електропровідності та проникності живих тканин, механізми фотобіологічних процесів. До кожної лабораторної роботи складені контрольні запитання, які включають як теоретичну, так і практичну частини роботи. Окремо наведені тестові завдання для поточного контролю знань студентів за розділами курсу,,Біофізика”.

Видання розраховане на студентів освітньо-кваліфікаційного рівня,,бакалавр” напряму підготовки,,Біологія”.

 

 

Рецензент О.М. Войтович

Відповідальний за випуск О. Ф. Рильський

 

ЗМІСТ

 

ВСТУП ……………………………………………………………………..4

Лабораторна робота № 1 ………………………………………………… 5

Лабораторна робота № 2…………………………………………….........10

Лабораторна робота № 3…………………………………………………13

Лабораторна робота № 4…………………………………………………16

Лабораторна робота № 5…………………………………………………18

Лабораторна робота № 6…………………………………………………21

Лабораторна робота № 7…………………………………………………25

Лабораторна робота № 8………………………………………………….27

ТЕСТОВІ ЗАВДАННЯ ДЛЯ ПЕРЕВІРКИ ЗНАНЬ ……………........31

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА …………… …….......................43

ПЕРЕЛІК ПИТАНЬ ДО ІСПИТУ ……………………………………..44

ВСТУП

 

Швидкий розвиток біологічної фізики супроводжується проникненням її в різні галузі біології та тісною взаємодією з суміжними дисциплінами – фізикою, хімією, математикою та фізичною хімією. Біофізика – це самостійна наука, яка має свій предмет і методи дослідження, власну теоретичну концептуальну базу та області програми. У даний час викладання біофізики в університетах здійснюється на основі біологічної або фізичної освіти.

Предмет біофізики досить складний і багатогранний, тому його викладання вимагає залучення не тільки матеріалів з різних розділів біології, а й широкого використання сучасних методів і уявлень фізики, математики, фізичної хімії. У цьому і полягають труднощі викладання біофізики.

Метою курсу є формування у студентів теоретичних знань та практичних навичок, спрямованих, насамперед, на вивчення фізичних методів досліджень властивостей і характеристик біологічних об'єктів та подальше використання отриманих результатів. Адже відомо, що практична робота студентів має особливе значення, оскільки дозволяє освоїти навчальний матеріал не тільки зі слів викладача, але й,,відчути” цей матеріал безпосередньо, виконуючи експеримент власними руками.

Завдання даного курсу полягає у виявленні єдності та різноманітті біологічних явищ шляхом розкриття загальних молекулярних механізмів взаємодій, які лежать в основі біологічних процесів.

Дані методичні вказівки складені відповідно до робочої програми з курсу,,Біофізика” та призначені для виконання лабораторних робіт студентами-біологами, а також можуть бути використанні ними під час науково-дослідної роботи.

 

 

Лабораторна робота № 1

В'ЯЗКІСТЬ БІОЛОГІЧНИХ РОЗЧИНІВ

Мета роботи: визначити в’язкість біологічних розчинів за допомогою капілярного віскозиметра, встановити залежність в’язкості досліджуваних розчинів від концентрації та температури.

Матеріали, реактиви, обладнання: віскозиметр капілярний, гумова груша, скляні колби, мірні склянки, фільтрувальний папір, дистильована вода, фізіологічний розчин, спирт, розчини сахарози 10 %, 20 %, 40 %.

 

Основні відомості

Гідродинамічні методи (вимірювання дифузії, седиментації, в’язкості) відіграють значну роль у вивченні властивостей біологічних рідин та макромолекул.

Під в’язкістю рідини ми будемо мати на увазі опір переміщення одного шару рідини відносно іншого. Безпосередньо причиною цього опору є міжмолекулярні сили (такі, як сили Ван-дер-Ваальса).

Всі рідини поділяються на ньютонівські та неньютонівські.

Ньютонівською називають рідину, швидкість протікання якої прямо пропорційна силі, що прикладається. До таких рідин відносяться: індивідуальні рідини (вода, спирт та ін.), істинні розчини високомолекулярних сполук (білки, нуклеїнові кислоти, полісахариди та ін.), розчини-колоїди, в яких частинки мають сферичну форму. У цілому в'язкість ньютонівських рідин не залежить від швидкості протікання. Рух таких рідин описується законом Ньютона:

F = ηS du/dx, де (1)

η – коефіцієнт в’язкості, який має розмірність [η] = маса/довжина * час;

S – площа шару взаємодії;

du/dx – градієнт швидкості.

Формулу (1) неможливо застосовувати для практичних розрахунків із-за труднощів експериментального визначення її складових. У практичних розрахунках користуються формулою Пуазейля:

η = Пr⁴Рt/81V, де (2)

r – радіус капіляра,

l – довжина капіляра,

V – об’єм рідини;

Р – напруга зміщення – сила, віднесена до одиниці поверхні.

Неньютонівські рідини характеризуються тим, що швидкість їх протікання не пропорційна силі, що прикладається, і в’язкість залежить від швидкості. До таких рідин відносяться системи, які мають внутрішню структуру, наприклад, колоїди, які мають внутрішню структуру, або колоїди, що мають частинки паличкоподібної та ниткоподібної форми, концентровані розчини високомолекулярних сполук.

В’язкість рідин повністю визначається коефіцієнтом η. У практиці замість η користуються η _відн.

η _відн. = η / η _0, де (3)

η_о - коефіцієнт в’язкості деякої еталонної рідини.

Наприклад такою еталонною речовиною при дослідженні в'язкості біологічних мембран є олія оливи. Питомою в'язкістю називають відношення:

η _пит. = η – η₀ / η₀ = η_відн – 1 (4)

а саме η_відн та η _пит. найчастіше фігурують у формулах, які характеризують в'язкі властивості рідин. В’язкість (η) залежить від концентрації речовини, тому більш інформативною є характеристична в'язкість:

[η] = lim_c->0 η _пит../С (5)

η – залежить від форми часточок:

для сферичних

η_відн = l+0,5Q/(l-Q)² ≈ l+2,5Q (6)

для асиметричних

η_відн.= 1+ 0,5Q / (1-Q)⁴ ≈ 1+4,5Q, де (7)

 

Q – об’ємна доля розчиненої речовини:

Q = nV_M/V, де (8)

n – число молекул

V_M – об’єм однієї молекули

V – об’єм розчину.

 

Нарешті, в’язкість розчину залежить від температури (η = А * е), а також тиску, заряду.

Таким чином η = η (C, Q, T, P).

 

Значення методу віскозиметрії:

1. Застосування в медицині. Знаходить широке застосування для діагностики. Патологічні процеси змінюють в'язкість крові, лімфи, цитоплазми клітин.

2. Молекулярна біологія. Використовуючи метод віскозиметрії, можна оцінити форму та масу молекул, а також співвідношення між окремими реагентами при протіканні реакцій. Наприклад, при розщепленні ДНК нуклеазами її маса зменшується і внаслідок цього зменшується в'язкість розчину.

 

ХІД РОБОТИ

Віскозиметр скляний капілярний типу ВПЖ-2 (див. рис.) представляє собою U-подібну трубку, в коліно (1) якої впаяно капіляр (7). Вимірювання в’язкості за допомогою капілярного віскозиметра базується на визначені часу протікання через капіляр певного об’єму рідини з вимірювального резервуара.

 

ПІДГОТОВКА ВІСКОЗИМЕТРА ДО РОБОТИ

Перед визначенням в’язкості віскозиметр повинен бути ретельно вимитий та висушений. Віскозиметр промивають хромовою сумішшю, спиртом або ацетоном. Після цього ретельно промивають дистильованою водою та висушують.

ПОРЯДОК ВИКОНАННЯ РОБОТИ

 

Для вимірювання часу протікання рідини через капіляр, рідину заливають у резервуар (6) віскозиметра через коліно (2). За допомогою гумової груші рідину набирають у капіляр (1) до 1/3 розширення (5).

Сполучають коліно (1) з атмосферою та визначають час опускання меніску рідини від відмітки М1 до відмітки М2.

 

Після закінчення роботи віскозиметр ретельно промивають дистильованою водою і висушують.

 

Завдання 1. Визначення відносної та питомої в’язкості фізіологічного розчину, спирту та сахарози.

 

У якості контролю взяти дистильовану воду, для якої за допомогою віскозиметра ВЖ-2 визначити час витікання t₀ при 22°С. Потім визначити t для фізіологічного розчину, спирту, сахарози. Розрахунки провести за формулами:

 

η _відн. = η / η₀ = t / t₀ та η _пит..= (η-η₀)/η₀ = (t-t₀)/t₀

 

Отримані дані занести до таблиці 1.

 

Таблиця 1.

Рідина	Швидкість протікання рідини, t, сек	η відн = t / t0	η пит. = (t-t0)/t0	[η] = η пит../С
1. 2. 3. 4. …

 

Завдання 2. Визначення характеристичної в’язкості.

Визначити відносну та питому в’язкість розчинів сахарози таких концентрацій: 20 %, 40 %. Для кожної концентрації зробити не менше 3-х вимірювань. У якості контролю взяти дистильовану воду. За даними табл. 1 побудувати графік залежності приведеної в’язкості від концентрації та визначити характеристичну в'язкість.

 

Завдання 3. Визначення впливу температури на в'язкість розчинів.

Для визначення впливу температури на в'язкість розчинів спочатку необхідно визначити питому в’язкість (як у завданні 1) для 20 % сахарози при таких фіксованих температурах: 22°С, 37^оС, 62°С. У якості контролю взяти дистильовану воду при тих самих температурах. Отримані дані занести до таблиці 2.

За даними розрахунків побудувати графік залежності питомої в’язкості від температури.

 

Таблиця 2

Рідина	Температура, Т^оС	Швидкість протікання рідини, t, сек	η відн = t / t0	η пит. = (t-t0)/t0
1. дист. вода     2. сахароза 20 %			- - -	- - -

 

 

Питання для самоконтролю

 

1. Розкрийте зміст поняття «в’язкість».

2. Що таке ньютонівські й неньютонівські рідини?

3. Які рідини відносять до ньютонівських?

4. Які рідини відносять до неньютонівських?

5. Закон Ньютона.

6. Закон (формула) Пуазейля.

7. Від яких параметрів залежить в’язкість рідини?

8. Що таке відносна в’язкість?

9. Що таке питома в’язкість?

10. Що означає та чим обумовлена характеристична в’язкість?

11. Яка залежність в’язкості від концентрації рідини та температури?

12. Значення методу віскозиметрії.

 

Лабораторна робота № 2.

ВИВЧЕННЯ ПРОНИКНОСТІ ТКАНИН

 

Мета роботи: вивчити проникність жаб’ячої шкіри для розчину барвника.

Матеріали, обладнання, реактиви: жаб’яча шкіра; фотоколориметр, набір препарувальних інструментів: скляні циліндри, гумові кільця, нитки, склянки; 0,05 % розчин метиленового синього на фізіологічному розчині, 0,125М розчин KCl, 0,05% розчин NaCl, спирт 70°.

 

Основні відомості

Проблема проникності (можливості клітин та тканин пропускати воду та розчинені в ній речовини) має велике значення в фізіології обміну речовин, у питаннях розподілу речовин між клітинами та тканинними рідинами, виникнення біопотенціалів та фармакології.

Для вивчення проникності клітин та тканин розроблено цілий ряд методів. Ступінь проникності оцінювалась за зменшенням об’єму клітини при дії на неї гіпертонічного розчину досліджуваної речовини та за наступною швидкістю зворотного деплазмолізу. Однак у його основі лежав надійний метод – застосування гіпертонічних розчинів, які, без сумніву, пошкоджують клітини.

Деякі дані про проникність клітин були одержані шляхом хімічного аналізу вмісту клітинної вакуолі великих рослинних клітин. Результати цих досліджень більш надійні, хоча в них для одержання достовірних даних автори використовували високі концентрації.

Ряд даних про проникність були одержані при вивченні проникності до клітини барвників. Однак, у цьому разі вивчалась звичайно не проникність, а адсорбція, констатувалось проникнення барвника тільки тоді, коли він накопичувався у великій кількості, інакше його присутність було б важко встановити.

З відкриттям ізотопів та розробкою методів мічених атомів відкрились більш широкі можливості вивчення проникності в значно більш нормальних фізіологічних умовах.

Основним механізмом переносу розчинених речовин через клітинні мембрани є дифузія. Швидкість дифузії визначається за законом Фіка, згідно якого швидкість потоку речовини із області з однієї концентрації в область з іншою концентрацією пропорційна градієнту концентрацій:

 

dm /dt = - DS *dc/ dx де:

m – кількість розчиненої речовини (г);

t – час (сек.);

S – площа поверхні розділу (см²);

D – коефіцієнт дифузії (см²*сек.);

c – концентрація речовини в г*см³.

x – відстань від початкової точки дифузії в см.

 

Константа дифузії залежить від в’язкості середовища та розміру молекул. Для вираження проникності клітин у формулі Фіка градієнт концентрації звичайно замінюють різницею концентрацій у зовнішньому середовищі й у клітинах, а коефіцієнт D замінюють коефіцієнтом проникності Р, який характеризує окрім D також опір, який клітини чинять проникненню до них речовин завдяки своїм біологічним особливостям. У такому разі проникність виражається формулою:

Dm /dt = PS (C₁ – С₂), де:

С₁ – С₂ – концентрації речовини, що вивчається з обох боків мембрани.

 

Необхідно відмітити, що в клітині у великій кількості нагромаджуються іони білків, фосфоліпідів, аніони амінокислот й інших органічних речовин, що нездатні дифундувати, вміст яких у рідині, що оточує клітину, є незначним.

У той же час у протоплазмі еритроцитів, м'язових та нервових волокнах міститься у 30 разів більше іонів калію, ніж їх є у міжклітинному середовищі, а іонів натрію у 8-10, іонів хлору в 50 разів менше, ніж поза клітиною.

Таке нерівномірне розподілення іонів між клітиною та позаклітинною рідиною обумовлене, вочевидь, не тільки дифузією під впливом різних градієнтів, але й іншими силами.

Для пояснення причин нерівномірного розподілу іонів у клітині та середовищі були запропоновані різні теорії.

Прибічники мембранної теорії проникності приписували головну роль у розподілі речовин між клітиною та середовищем клітинній мембрані, проникній для одних речовин і непроникній для інших.

Фазова теорія стверджує, що в основі розподілу речовин між живим організмом та зовнішнім середовищем є процеси сорбції на внутрішньоклітинних структурах. Однак, ця теорія не пояснює механізму проникності, а тільки допомагає зрозуміти механізм перерозподілу речовин, мається на увазі кінцевий результат.

В останні роки обидві ці теорії розвивалися в цілому ряді робіт. Окрім цього, накопичено значний експериментальний матеріал з питання проникності. Все це дало змогу зробити висновки відносно механізму проникності цілого ряду речовин з оточуючого середовища в клітину. •

ХІД РОБОТИ

Завдання 1. Вивчити проникність шкіри жаби для метиленового синього у фізіологічному розчині.

Мішечки зі шкіри жаби закріпити за допомогою гумових кілець на кінчиках скляних циліндрів у двох положеннях: епітелієм у середину, та назовні (рис. 1). Наповнити шкіряні мішечки фізіологічним розчином, щоб упевнитися в їх герметичності. Замінити фізіологічний розчин 0,05% розчином барвника. Налити в склянку рівну кількість фізіологічного розчину. Помістити в склянки шкіряні мішечки. При цьому слідкувати, щоб рівень барвника в циліндрі та фіз. розчину в склянці співпадав. Через 1 годину зі склянок видалити шкіряні мішечки, а розчин, що знаходиться в склянках, виміряти за допомогою ФЕКу.

 

 

 

Рис. 1. Мішечки зі шкіри жаби: А - епітелієм у середину; Б – епітелієм назовні.

 

Завдання 2. Вивчити проникність шкіри жаби для метиленового синього у дистильованій воді, у 0,125 М розчині КСІ та 70° спирті.

 

Аналогічні досліди провести зі шкіряними мішечками, які попередньо знаходилися протягом 30 і 60 хвилин у дистильованій воді, 0,125 М розчині КСІ, 70° спирті. Результати дослідів занести до таблиці.