Методы генодиагностики ифекционных заболеваний

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ. Была предложена в 1983г. Принцип: многократное образование копий (амплификация) определённого участка ДНК с помощью ДНК-полимеразы. ЭТАПЫ:

1) ТЕРМИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ 2-хнитевой ДНК на отдельные цепочки (93-95°С в течение 30 секунд).

2) ОХЛАЖДЕНИЕ СРЕДЫ И ВНЕСЕНИЕ ПРАЙМЕРОВ, комплементарных нуклеотидным последовательностям обоих цепочек. Используют синтетические праймеры – олигонуклеиды из 10-20 НКт, взаимодействующих с концами отдельных нитей исходной ДНК. Точнее добавляют 2 праймера (комплиментарны). Взаимодействие праймеров называют ОТЖИГОМ (реакция проходит за 20-60 с при 50-65°С).

3) Вносят СПЕЦ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ ПОЛИМЕРАЗУ (оптимум 70°С), к/я синтезирует вторичные копии цепей ДНК (ампликоны).

4) Полученные 2-хнитчатые ДНК снова подогревают, остужают, вносят праймеры и т.д.

Т.к. полимераза устойчива к воздействию t°С, то нет необходимости постоянно её добавлять. После 30-80 циклов проводят идентификацию ДНК методом электрофореза. Подсчитано, что за 30-40 циклов из 1 матрицы образуется 100.000.000 (100 млн) ампликонов. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю молекулы можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или провести ДНК-гибридизацию. ПЦР – оч чувствительный метод, теоретически достаточно иметь в среде лишь 1 молекулу ДНК.

Для ДИАГНОСТИКИ ИНФ ЗАБ-Й маркёром возбудителя явл его геном. Для амплификации отбирают какой-нибудь УНИКАЛЬНЫЙ ген, наиболее отличающий его от других патогенов.

Сальмонеллы

Род Salmonella включает возбудителей брюшного тифа и паратифов, сальмонеллеза (S.typhimurium, S.infantis, S.anatum, S.enteritidis).

Морфология. Мелкие палочки, большинство подвижны (перитрихи). Ни спор, ни капсул сальмонеллы не об­разуют. Большинство сальмонелл хорошо растут на простых пит средах. На поверхности плот сред образуют не­большие (2–4 мм), прозрачные колонии. Вокруг ко­лоний S.schottmulleri образуется слизистый вал. Это – Д-Д признак данного мкÒ.

Антигены. Обладают О-, Н-, обнаруживаются К-Аг (Vi-Аг у тифозной палочки = 52, 6, 75), локализованные в микрокапсуле.

О-АГ (ЛПС) термостабилен, выдерживает кипя­чение в течение 2,5 ч, инактивируется формалином. В соответствии с содержанием О-АГ все сальмонеллы разделены на 65 серогрупп, обозна­ченных буквами лат алфавита (А, В, С3– С14, D и т.д.). В каждую СЕРОГРУППУ включены сальмонеллы с идентичным одним или несколь­кими О-АГ (серогруппа В содержит сальмо­неллы с О-АГ 1,4,12; из них специфичным для серогруппы является 4). Дифференциация сальмонелл ВНУТРИ серогрупп проводится по АГ специфичности Н-АГ, которые могут существовать в двух ФАЗАХ, 1 обозначают строчными буква­ми лат алфавита (а, b, с, d и т. д.), 2 – обычно араб­скими цифрами, редко латинскими буквами. Фазовые вариации Н-АГ сальмонелл происходят с высокой частотой. Каждый серовар сальмонелл имеет наименование – часто по названию места открытия (S.dublin, S.moscow) или по автору (S.schottmulleri), основному симптому вы­зываемой болезни (S. typhy). Наименованию соответствует АГ формула (S.paratyphi А – 1,2,12,а).

Патогенность связана со способностью прони­кать и размножаться в МКфагах. После гибели МК­фагов мкÒ попадают в лимфу, кровь – патологи­ческий процесс генерализуется. Но серовары об­ладают неодинаковыми факторами патогенности Þ клиническая картина сальмонеллёзов разная.

Сальмонеллы – возбудители БРЮШНОГО ТИФА и ПАРАТИФОВ.

Тифозная палочка не ферментирует лактозу(–), сахарозу(–), рамнозу(–), но расщепляет глюкозу(+), мальтозу(+), маннит(+), с образованием кислоты, паратифозные Б!! ферментируют те же углеводы, но с образованием кислоты и газов. На среде РЕССЕЛЯ S.paratyphi А –/КГ, S.typhi –/К, E.coli К/КГ.

Возбудители тифа и паратифа различаются по АГ структуре. S.paratyphi А составляет серогруппу A, S.paratyphi В (schottmulleri) включена в группу В, а S.typhi – в группу D. Тифозная палочка обладает Vi-АГ, который содержится в вирулентных штаммах и является специфическим рецеп­тором для Vi-фагов. Их исп для ФАГОТИПИРОВАНИЯ в эпидемиологических целях.

Экология и распространение. Возбудители широко распространены. Обитают в организме чка, их можно обнаруживать в местах, куда попадают выделения больных и бактерионосителей. Обладают относительно высокой устойчивостью к действию физических и химических факторов окружающей среды. В сточных водах, в почве, куда они попадают с испражнениями людей, могут длительно сохранять­ся. Чувствительны к нагреванию и дезинфектантам.

S. typhi и S. paratyphi А вызывают заболевания только у человека, S. paratyphi В (schottmulleri) – преимущественно у человека, но может вызывать заболевания КРС. ИСТОЧНИКОМ являются больные и бактерионосители. ПЕРЕДАЧА происходит контактным и алиментарным путями.

Патогенез брюшного тифа. Сальмонеллы тифа и паратифов попадают в организм через рот, многие погибают в желудке, а оставшиеся переходят в тонкую кишку. АДГЕЗИНЫ обеспечивают прикрепление к микроворсинам кишечного эпителия, ИНВАЗИВНЫЕ свойства – проникновение в лимфатические фолликулы. За­тем по лимфатическим сосудам возбудители проникают в бры­жеечные лимфоузлы, где размножаются. В конце инкубационного периода (в среднем 2 НЕД) сальмонеллы из лимфоузлов попадают в грудной проток, затем в кровеносную систему – наступает бактерие­мия, появляются клинические симп­томы болезни. Бактериемия сохраняется на протяжении всего лихорадочного периода, но количественно она наиболее выра­жена в течение 1-й недели болезни.

Гематогенным путем возбудители попадают в различные ор­ганы (печень, селезенку, костный мозг и др.), где возникают брюшнотифозные гранулемы. Из органов мкÒ повторно поступают в ток крови, поддерживая бактериемию. Наиболее благоприятные условия для существования и размножения – в желчных протоках печени, в желчном пузыре. С желчью они выделяются в просвет 12п кишки, попадают в тонкую кишку, где повторно внедряются в уже сенсибилизированные лимфати­ческие фолликулы. Развивается воспалительная аллергическая реакция, в стенке кишки образуются язвы. НА 3-Й НЕДЕЛЕ болезни возбудители в большом кол-ве выделяются с испражнениями. Элимина­ция возбудителей осуществляется и с мочой. В этот период болезни фекалии и мочу исследуют в диагностических целях.

В патогенезе брюшного тифа большую роль играет ИНТОКСИ­КАЦИЯ. Эндотоксин д-ет на сердечно-сосудистую и нервную системы.

Иммунитет. В сыворотке больных появляются Ig, к/е активируют фагоцитоз, способствуют лизису бактерий. Титр антител нарастает от вто­рой к последующим неделям. Определение их используют в серодиагностике.

У переболевших формируется пожизненный иммунитет. Но у части больных возникают рецидивы и бактерионосительство (связано с недостаточным гуморальным иммунитетом). Если иммунная система несовершенна, то постинфекционное бактерионосительство может продолжаться в течение многих лет (причины ещё не изучены).

Лабораторная диагностика – выделение ВОЗБУДИТЕЛЕЙ из организма больного и обнаружение специфических Ат. Возбудитель выделяют на 1-Й НЕДЕЛЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ИЗ КРОВИ, В ПОСЛЕДУЮЩИЕ ПЕРИОДЫ – ИЗ ИСПРАЖНЕНИЙ, МОЧИ, ЖЕЛЧИ. Выделенные культуры идентифи­цируют по биохимическим и АГ свойствам. Тифозную палочку фаготипируют Vi-фагами с целью установления источника и путей передачи возбудителя при массовых заболеваниях брюшным тифом.

В сыворотке крови определяют АНТИТЕЛА (СО 2-Й НЕДЕЛИ), в последующие недели титр увеличивается. Применяют реакции агглютинации по Видалю, РНГА с эритроцитарными О- и Vi-диагностикумами, ИФА, РИА, коагглютинации.

Профилактика и лечение. Специфическая профилактика состоит в вакцинации, но не проводится, т.к. вакцины малоэффективны. Контактным лицам назначают внутрь брюшнотифозный бактериофаг. Для лечения больных из этиотропных препаратов чаще всего применяют левомицетин.

Возбудители ГАСТРОЭНТЕРОКОЛИТОВ (САЛЬМОНЕЛЛЕЗОВ)

Сальмонеллезы клинически проявляются как гастроэнтероколиты, вызывают их многие сальмонеллы различных серогрупп. Они различаются по некоторым БХ признакам, но дифференцируют их в осн по АГ структуре. Наиболее часто вызыва­ют – S. typhimurium, S. infantis, S.enteritidis.

ИСТОЧНИК – различные животные (КРС, свиньи, лошади, собаки, кошки, гры­зуны, домашние птицы), чк заболевает при употреблении мяса, яиц, молочные, кондитерские продук­ты, изготов­ленные с использованием яиц, не подвергнутых термической обработке.

Экология и распространение. Устойчивы к воздействию факторов окружающей среды, погибают при кипячение. Но при низких температурах (холодильник) длительно остаются жизнеспособ­ными.

Патогенез. Возбудители сальмонеллеза попа­дают с пищей. Из просвета кишечника они внедряются в энтероциты, в составе фагосомоподобных вакуолей достигают собственной пластинки слизистой, где фагоцитируются МКфагами и лейкоцитами. Стен­ка кишки при этом не повреждается. В энтероцитах происходит всасывание продуктов жизнедеятельности, эндотоксина и воздействие микробных ферментов (протеаз, муциназ, декарбоксилаз и др.). В МК­фагах сальмонеллы размножаются, а при гибели фагоцитов освобождаются медиаторы воспаления (гистамин, серотонин и др.). По лимфатическим путям бактерии проходят в лимфоузлы, в некоторых случаях – генерализация Þ попадание и размножение во внутренних органах.

ТОКСИНЫ (эндотоксин, энтеротоксин, цитотоксин) оказывают прямое повреждающее действие на # слизистой Þ нарушают проницаемость # мембран, развивается интоксика­ция, диарея, наступает обезвоживание Ò. В патогенезе возбудитель и токсины играют роль пускового механизма, а уже нару­шения функции ЖКТ, ССС, НС обуславливают клинику. Ч/з 3-5 дней – выздоровление, иногда при генерализации – болезнь затягивается.

Иммунитет ненапряженный, т.е. возможно носительство и повторные заболевания. В сыв крови – агглютинины, преципитины, бактериолизины, опсонины. МЕСТНЫЙ им-т: ↑ SIgA. Заб-я, вызванные одним сероваром, не создают иммунитета к другим Þ возможны ВТОРИЧНЫЕ инфекции.

Лабораторная диагностика. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ метод. Выделенные из испражнений, рвотных масс, промыв­ных вод желудка культуры идентифицируют, определяют серовар, одновременно исследуют пищ прод.

Профилактика и лечение. Специф проф не разработана. Антибиотики (левомицетин, ампициллин и др.) - для лече­ния только генерализованных форм.