Накопительные и чистые культуры микроорганизмов.

 

 

Рост. Различают сбалансированный рост, когда увеличение всех веществ и структур происходит пропорционально. Если в среде есть нехватка или избыток каких-либо компонентов, то рост становится несбалансированным, т.е. какие-то продукты метаболизма могут преобладать.

 

Чтобы правильно оценивать рост культуры, необходимы следующие параметры:

· концентрация клеток, клеток/мл;

· время генерации — промежуток времени, за который число клеток удваивается; • константа скорости деления — число удвоений в час;

· константа скорости роста. Важной характеристикой культуры является константа скорости роста — «мю», которая зависит от условий выращивания (если условия стандартные, то для данной культуры она совершенно определенная).

· выход биомассы - разность между максимальной и исходной массой бактерий (г сухого в-ва).

· экономический коэффициент — отношение урожая клеток к количеству потребленного субстрата (г).

 

При изучении свойств микроорганизмов, для получения биомассы необходимо размножать и выращивать их в условиях лаборатории.

Культивирование, или выращивание, микроорганизмов возможно лишь при создании определенных условий для их жизнедеятельности. Из-за малых размеров микроорганизмов работа в лаборатории проводится не с одной особью, а с популяцией организмов, или культурой. Культура микроорганизмов, состоящая из клеток одного вида, называется чистой культурой. Если число видов два или больше, что говорят о смешанной культуре.

При выделении чистой культуру из природных местообитаний на первом этапе обычно пользуются предложенным Виноградским методом получения накопительных культур, в которых преобладают организмы определенной группы. Накопление желаемых микроорганизмов происходит за счет создания элективных условий культивирования, благоприятных для данной группы. Другие организмы, также присутствующие в пробе, в этих условиях либо не размножаются, либо характеризуются незначительным ростом.

После того как получена накопительная культура, приступают к выделению чистой культуры. Она может быть получена из отдельной колонии или одной клетки.

Выделение из отдельной колонии: принцип Коха. Данный метод заключается в получении чистой культуры из отдельной колонии. Неприменим для выделения организмов, которые не растут или плохо растут на плотных средах.

Для выделения чистой культуры аэробных микроорганизмов накопительную культуру высевают на поверхность плотной среды с помощью шпателя. Этим же шпателем протирают поверхность второй, третьей и четвертой чашки. В последних чашках будет наблюдаться рост изолированных колоний. Далее из этих накопительных культур рассевают еще в чашки бактериологической петлей. Чашки ставят в термостат. Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на пов-ть скошенной плотной среды в пробирке или в жидкую среду.

- метод глубинного посева: изолированные колонии микроаэрофильных микроорганизмов и факультативных анаэробов чаще получают этим методом. Плотную питательную среду разливают в пробирки и стерилизуют. Потом среду расплавляют и проводят высев из разведений накопительной культуры в стерильной водопроводной воде. В пробирку с расплавленной средой вносят 1 мл одного из разведений накопительной культуры. Перемешивают и около пламени горелки выливают содержимое пробирки в стерильную чашку Петри. Среда застывает, чашку ставят в термостат. Колонии вырезают стерильным скальпелем, извлекают и переносят в жидкую среду, благоприятную для развития организмов.

- метод вращающихся пробирок: когда хотят получить изолированные колонии облигатных анаэробных бактерий, характеризующихся особенно высокой чувствительностью к кислороду, используют метод Хангейта. Расплавленный агар засевают бактериями при постоянном токе через пробирку стерильного инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку. Среда равномерно распределяется и застывает тонким слоем. Тонкий слой среды позволяет получить изолированные колонии, видные невооруженным глазом.

 

Выделение из одной клетки возможно двумя способами:

- капельный метод: с помощью микроманипулятора или с помощью микроселектора. Используют при работе с крупными микроорганизмами. Накопительную культуру разводят в стерильной среде с расчетом на одиночные клетки. Затем на поверхность нескольких стерильных стекол наносят по капле разведения. Готовят препараты «висячая капля». Капли просматривают и отмечают те, в которых только одна клетка. Препарат помещают во влажную камеру. Через сутки опять микроскопируют. Капли, в которых образовались микроколонии, переносят в пробирки. Микроманипулятор — прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки извлекать из суспензии одну клетку. Микроселектор — почти то же самое.

 

Основные типы сред (по составу и физическому состоянию). Потребности микроорганизмов в пит. в-вах чрезвычайно разнообразны и определяются особенностями их метаболизма.

1) Питательная среда должна включать доступный для клетки источник энергии (для одних - это свет, для других - органический или неорг. субстрат)

2) Среда должна содержать все необходимые компоненты для реализации конструктивных процессов в клетке. Потребности микроорганизмов в некоторых аминокислотах часто удовлетворяют добавлением к среде гидролизат белка. Чаще всего используют гидролизат казеина. Наиболее требовательные организмы культивируют на средах, содержащих белки или продукты их неполногорасщепления — пептоны. Многие организмы требуют наличия в среде факторов роста, к которым относятся пурины, пирамилины и аминокислоты.

Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или нескольких факторов роста.

Микроорганизмы могут также нуждаться в витаминах. Для построения в-ва клетки микроорганизмам необходимы фосфор, сера, калий и др. Нужны также металлы: калий, натрий, кальций, магний и другие, которые микрорганизмы получают в виде катионов из солей.

 

По составу среды для культивирования микроорганизмы делят на натуральные (естественные) и синтетические. К натуральным относятся среды, состоящие из продуктов животного или растительного происхождения: овощные или фруктовые соки, молоко, животные ткани, кровь, морская вода, отвары, экстракты. К натуральным относят полусинтетические среды, состоящие из природных продуктов в комбинации с рядом опр. хим. соединений. Синтетические среды представляют собой комплекс определенных химически чистых соединений, взятых в точно указанных концентрациях.

По физическому состоянию среды могут быть жидкими, полужидкими, твердыми (плотными) и сыпучими.