Прямая и непрямая реакция Кумбса

Тест Кумбса бывает непрямой и прямой, в зависимости от этого он производится в один либо же два этапа. В ходе осуществления прямой реакции Кумбса – с условием, что антитела уже закреплены на поверхности эритроцитов – антиглобулиновая сыворотка добавляется к сыворотке исследуемой крови, и осуществляется агглютинация эритроцитов.

В случае, когда в плазме крови антитела находятся в свободном состоянии проводится непрямой тест Кумбса. На первом этапе надо зафиксировать антитела на поверхности эритроцитов, для этого нужна инкубация эритроцитов и сыворотки крови. Потом добавляется антиглобулиновая сыворотка.

Неполные антитела в отличии от нормальных моновалентны, поскольку они имеют один активный центр, способный взаимодействовать только с одним эпитопом: в то время как другие эпитопы остаются не связанными. В результате этого не происходит образования крупных комплексов, выпадающих в осадок в растворе электролита. Последние проявляются только в реакциях с бивалентными АТ. Для исправления этого положения вводится антиглобулиновая сыворотка (АГС), содержащая бивалентные АТ к глобулину, которая свяжет между собой моновалентные АТ. Содержащиеся в исследуемом материале. Таким образом произойдет визуально видимая гемагглютинации или агглютинация, свидетельствующая о наличии в исследуемой сыворотке неполных (моновалентных) антител. Например, в случае беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом у нее в сыворотке крови появятся неполные антитела. Для их выявления в пробирку с исследуемой сывороткой крови вносят резус- положительные эритроциты, а затем АГС. Появление гемагглютинации свидетельствует о положительной реакции.

ВОПРС 28

В качестве метки используются светящиеся флюорохром-ные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний — для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.

Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.

Компоненты прямой РИФ:
1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.);
2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену;
3) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.
Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию — свечение.

Компоненты непрямой РИФ:
1) исследуемый материал;
2) специфическая антисыворотка;
3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая флюорихромом;
4) Изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем — меченой антиглобулиновой сывороткой.

Светящиеся комплексы АГ-АТ — меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.
Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.

Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ — меченые — АТ-комплемент.

 

 

ВОПРОС 29(КОА)

Этот тип иммунологической реакции основан на способности специфических антител — антитоксинов подавлять биологическую активность экзотоксинов бактерий.

Реакции нейтрализации токсина антитоксической сывороткой in vitro
1) Реакция флокуляции. Феномен флокуляции — помутнение — внешнее проявление образования комплекса экзотоксин (анатоксин) + антитоксин в оптимальных количественных соотношениях ингредиентов.

Реакция применяется:
- для определения специфической активности токсинов (анатоксинов) по стандартной антитоксической сыворотке (МЕ/мл),
- для титрования антитоксических сывороток по известному анатоксину или токсину (метод Рамона). Активность сывороток выражается в МЕ/мл принимается то минимальное количество сыворотки, которое даёт интенсивную «инициальную» флокуляцию. Например, эта реакция применяется для определения активности дифтерийного, столбнячного, ботулинического, гангренозного анатоксинов и титрования противодифтерийной, противостолбнячной, протиаоботулинической, прогивогангренозной и др. антитоксических сывороток.

 

Реакция нейтрализации на животных применяется:
- для определения специфической активности анатоксинов по стандартной антитоксической сыворотке и по опытной дозе токсина. Активность анатоксинов выражается в единицах связывания (ЕС), ЕС -количество анатоксина, которое целиком связывается с ШЕ/мл антитоксической сыворотки;
- для идентификации бактерий (возбудители газовой анаэробной инфекции, столбняка, ботулизма и др.) по стандартной антитоксической сыворотке;
- для титрования антитоксических сывороток (противодифтерийная, противостолбнячная и др.) по стандартному токсину. Специфическая активность сывороток выражается в международных антитоксических единицах (МЕ). 1МЕ —минимальное количество сыворотки, которое способно нейтрализовать определенную дозу токсина, выражающуюся в стандартных единицах: смертельных, некротических или реактивных дозах, в зависимости от вида токсина и способа титрования.

Титрование антитоксических сывороток по известной смертельной (опытной) дозе токсина.

Проводится в 2 этапа:
1) определение опытной дозы токсина. Смертельная доза — это количество токсина, которое в смеси с 1МЕ стандартной сыворотки вызывает гибель 50 % взятых в опыт животных;
2) к различным разведениям испытуемой сыворотки добавляют опытную дозу токсина, инкубируют 45 минут и вводят животным. По результатам производят расчет
титра сыворотки.

ВОПРОС 30

Реакция флоккуляции(РФ) –

ПРИМЕНЕНИЕ: используется для титрования

антитоксических сывороток, токсинов и анатоксинов.

В реакции флоккуляции в качестве антигена участвует токсин или анатоксин. При

смешивании их в эквивалентных соотношениях с антитоксической

сывороткой появляется помутнение, а затем рыхлый осадок. Механизм РФ

сходен с таковым реакции преципитации.

В реакциях флоккуляции участвуют в качестве компонентов

токсины, анатоксины, антитоксины (антитоксические сыворотки).

Необходимым условием флокуляции является адсорбция одной макромолекулы или ассоциата макромолекул на нескольких частицах и образованием хлопьев, состоящих из частиц, связанных полимерными мостиками.

Реакция состоит в том, что при смешении токсина с соответствующей иммунной сывороткой происходит помутнение в ряде пробирок. Сначала в одной из них, а затем и в других ближайших к ней выпадает хлопьевидный осадок (флокулят). Этот ряд давших помутнение и осадок пробирок называется «зоной флокуляции», а пробирка, в к-рой раньше других выпал флокулят, называется пробиркой «инициальной» флокуляции. Выпадение осадка происходит при условии полной нейтрализации токсина антитоксином. Инициальная Ф. обычно соответствует той предельной дозе антитоксической сыворотки, к-рая еще способна обезвредить данное количество токсина. Поэтому по инициальной Ф. можно вычислить антитоксический титр сыворотки. С другой стороны, зная сколько антитоксических единиц содержится во взятой дозе сыворотки, можно по инициальной Ф. определить и антигенную силу токсина.

 

ВОПРОС 33

Теория иммунитета Эрлиха — одна из первых теорий антителообразования, согласно которой у клеток имеются антигенспецифические рецепторы, высвобождающиеся в качестве антител под действием антигена.
П. Эрлих каким-то образом осознал, что и до контакта с конкретным микробом в организ­ме уже есть антитела в виде, который он назвал "боковыми цепями". Как мы теперь знаем, это именно так, и "боковые цепи" Эрлиха — это подробно изученные в наше время рецеп­торы лимфоцитов для антигенов.

Ерне выдвинул вариант селективной теории. По его представлениям, в организме постоянно присутствуют антитела самой разнообразной специфичности. Антитело после взаимодействия с соответствующим антигеном поглощается фагоцитирующими мононуклеарами, что приводит к активной продукции этими клетками антител исходной специфичности.

Особое место в иммунологии занимает клонально-селекционная теория иммунитета М.Бернета. Он использовал представления П.Эрлиха и Н. Ерне о предсуществовании антител разной специфичности, но указал на то, что каждое специфическое антитело синтезируется отдельным клоном клеток. По М.Бернету, при дифференцировке лимфоцитов от стволовой кроветворной клетки и при параллельном процессе мутационных изменений в генах, контролирующих синтез специфических антител, возникают клоны клеток, которые способны взаимодействовать только с антигеном соответствующей специфичности. В результате такого взаимодействия формируется отобраный по специфичности клон, который либо секретирует антитела заданной специфичности, либо обеспечивает строго специфическую клеточную реакцию.

ВОПРОС 31

Иммуноферментный анализ

В настоящее время иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее широко

распространенным иммунологическим методом

• антитела или антигены фиксируются на внутренней поверхности

полистироловых планшетов для иммунологических реакций;

• в качестве метки используется фермент

• реакция учитывается визуально, после добавления в лунку

субстрата для данного фермента.

Метод ИФА с использованием индикаторных полосок (иммунохроматография) широко

используется в развитых странах для самотестирования.

Поверхность индикаторной полоски покрыта антителами

против выявляемого антигена. Вместе с антителами на твердой фазе иммобилизованы

молекулы фермента глюкозооксидазы. Готовую полоску погружают в исследуемый образец.

Антитела связывают молекулы антигена из пробы. Степень заполнения вакантных антител

пропорциональна концентрации антигена. Затем индикаторную полоску переносят в раствор,

содержащий конъюгат стандартного антигена с пероксидазой, субстрат для глюкозооксидазы

Регистрацию проводят визуально

Анализируемый материал (сыворотки, слюна, моча) не требует

предварительного разведения и дополнительной обработки.

Иммуноферментный анализ или метод – выявление антигенов с помощью

соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой. После соединения

антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат-хромоген.

Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции – интенсивность

окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА

применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности

для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов,

По сравнению с ранее описанными методами ИФА обладает существенными

преимуществами:

❖ высокой чувствительностью, позволяющей выявлять до 0,05 нг/мл антигенного

материала;

❖ высокой специфичностью за счёт использования моноклональных антител,

взаимодействующих со строго определёнными эпитопами анализируемых антигенов;

❖ автоматизацией всех этапов проведения исследования.

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Определение неизвестных антител включает в себя следующие этапы: 1) связывание

известного антигена с пластиком лунки планшета; 2) внесение испытуемой сыворотки; 3)

внесение конъюгата (меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки); 4) внесение

хромогенного субстрата.

Определение неизвестных антигенов состоит из таких этапов: 1) связывание антител,

специфичных для искомого антигена, с пластиком лунки планшета; 2) внесение

антигенсодержащего материала; 3) внесение 2-х антител той же специфичности; 4) внесение

конъюгата (меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки); 5) внесение хромогенного

субстрата.

 

 

ВОПРОС 34

Иммунологическая толе­рантность — явле­ние, противоположное иммунному ответу и иммунологической памяти. Проявляется она отсутствием специфического продуктивного иммунного ответа организма на антиген в связи с неспособностью его распознавания.
Имму­нологическая толерантность предполагает изначальную ареактивность иммунокомпетентных клеток к определенному антигену.
Иммунологическую толерантность вызы­вают антигены, которые получили название толерогены. Ими могут быть практически все вещества, однако наибольшей толерогенностью обладают полисахариды.
ВИДЫ.

Иммунологическая толерантность быва­ет врожденной и приобретенной. Примером врожденной толерантности является отсутс­твие реакции иммунной системы на свои собственные антигены. Приобретенную толе­рантность можно создать, вводя в организм вещества, подавляющие иммунитет (иммунодепрессанты), или же путем введения антигена в эмбриональном периоде или в первые дни после рождения индивидуума. Приобретенная толерантность может быть активной и пассив­ной. Активная толерантность создается пу­тем введения в организм толерогена, который формирует специфическую толерантность. Пассивную толерантность можно вызвать ве­ществами, тормозящими биосинтетическую или пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток (антилимфоцитарная сыворотка, цитостатики и пр.).
Иммунологическая толерантность отличает­ся специфичностью — она направлена к строго определенным антигенам. По степени рас­пространенности различают поливалентную и расщепленную толерантность. Поливалентная толерантность возникает одновременно на все антигенные детерминанты, входящие в со­став конкретного антигена. Для расщепленной, или моновалентной, толерантности характер­на избирательная невосприимчивость каких-то отдельных антигенных детерминант.
Известно, что ее основу составляют нормальные процессы регуляции иммунной системы. Выделяют три наиболее вероятные причины развития имму­нологической толерантности:
1. Элиминация из организма антигенспецифических клонов лимфоцитов.
2. Блокада биологической активности иммунокомпетентных клеток.
3. Быстрая нейтрализация антигена анти­телами.
Л. Фелтон (1949 г.) описал феномен иммунологической неотве-чаемости по отношению к пневмококкам у мышей, которая воз­никла после инъекции им большого количества пневмококкового полисахарида. развития иммунитета не про­исходит, а возникает полная ареактивность по отношению к пневмококкам и зараженные после этого животные погибают. Этот феномен получил название иммунологического паралича. Он спе­цифичен, зависит от дозы антигена и продолжается до тех пор, пока антиген персистирует в организме. Состояние иммунологического паралича сохраняется в течение 2—3 мес. Его можно продолжить повторны­ми инъекциями антигена.

ВОПРОС 35

Иммунологическая память.
Иммунологическая память. При повторной встрече с антигеном орга­низм формирует более активную и быструю иммунную реакцию — вторичный иммунный ответ. Этот феномен получил название имму­нологической памяти.
Иммунологическая память имеет высо­кую специфичность к конкретному анти­гену, распространяется как на гуморальное, так и клеточное звено иммунитета и обус­ловлена В- и Т-лимфоцитами. Она обра­зуется практически всегда и сохраняется годами и даже десятилетиями. Благодаря ей наш организм надежно защищен от повторных антигенных интервенций.
На сегодняшний день рассматривают два наиболее вероятных механизма формирова­ния иммунологической памяти. Один из них предполагает длительное сохранение анти­гена в организме.Пример: персистирующие вирусы кори, некоторые другие патогены длительное время, иногда всю жизнь, сохраняются в организме, под­держивая в напряжении иммунную систему. Вероятно также наличие долгоживущих де­ндритных АПК, способных длительно сохра­нять и презентировать антиген.
Другой механизм предусматривает, что в про­цессе развития в организме продуктивного им­мунного ответа часть антигенореактивных Т- или В-лимфоцитов дифференцируется в малые покоящиеся клетки, или клетки иммунологической памяти. Эти клетки отличаются высокой спе­цифичностью к конкретной антигенной детер­минанте и большой продолжительностью жизни (до 10 лет и более). Они активно рециркулируют в организме, распределяясь в тканях и органах, но постоянно возвращаются в места своего про­исхождения за счет хоминговых рецепторов. Это обеспечивает постоянную готовность иммунной системы реагировать на повторный контакт с антигеном по вторичному типу.
Феномен иммунологической памяти широко используется в практике вакцинации людей для создания напряженного иммунитета и под­держания его длительное время на защитном уровне. Осуществляют это 2—3-кратными при­вивками при первичной вакцинации и перио­дическими повторными введениями вакцинно­го препарата — ревакцинациями.

Вопрос 37

37. Препараты, содержащие антитела (антитоксические, анти-

микробные сыворотки, гамма-глобулины и иммуноглобули-

ны), их характеристика, получение, титрование. Серотерапия

и серопрофилактика.

Анатоксины – экзотоксин, обезвреж. формалином и выдержан.при t=37° 1 мес., не ядовит, но иммуногенен, очищ. от балластных б-ков, адсорбируют на Al(OH)₃. Искус.актив. антитоксич. им-т. АКДС – убит.б. коклюша + дифтерий. и столбняч. анатоксины. Для проф-ки.

Антитоксические сыворотки содержат антитела против экзотоксинов. Их получают путем гипериммунизации животных (лошадей) анатоксином.

Активность таких сывороток измеряется в АЕ (антитоксиче­ских единицах) или ME (международных единицах) — это минимальное количество сыворотки, способное нейтрализовать определенное количество (обычно 100 DLM) токсина для жи­вотных определенного вида и определенной массы. В настоящее время в России

антитоксические сыворотки:

• противодифтерийная;

• противостолбнячная;

широко используются следующие

• противогангренозная;

• противоботулиническая.

Применение антитоксических сывороток при лечении соответ­ствующих инфекций обязательно.

3. Антимикробные сыворотки содержат антитела против клеточных антигенов возбудителя. Их получают иммунизацией животных клетками соответствующих возбудителей и дозируют в милли­литрах. Антимикробные сыворотки могут применяться при лечении:

• сибирской язвы;

• чумы;

• стрептококковых инфекций;

• стафилококковой инфекции;

• синегнойной инфекции.

Их назначение определяется тяжестью течения заболевания и, в отличие от антитоксических, не является обязательным.

Препараты Ig(имуноглобулины) – содерж. только Ат без др. б-ков. 95% IgG и 5% IgM. Готовят из сывороток осаждением Ig. Гомологич. – из крови людей (грипп, столб., коклюш, HBV), гетерологич. – кровь имм. лошадей (клещ.энц, бешен.). Проф-ка и лечение.Из выделяемой фракции глобулинов получают иммунологически активные препараты: гамма-глобулин и полиглобулин.

Препараты иммуноглобулинов представляют собой концентраты антител - продуктов иммунного обмена, опсонизирующая, нейтрализующая и комплементсвязывающая активность которых является основным фактором их клинической эффективности

Иммуноглобулины-антитела распознают и связывают антигены. В результате связывания они могут немедленно нейтрализовывать токсины, превращать антигены в крупные агрегаты, способствовать поглощению микробных, различных чужеродных клеток и агрегатов фагоцитами. В фагоцитах иммунные комплексы и клетки разрушаются гидролитическими и другими ферментами. Одновременно изменение в молекулах иммуноглобулинов приводит к запуску параллельных механизмов защиты, таких как активация комплемента и др. Готовят иммуноглобулины из крови с высоким титром антител: крови людей, перенесших данную инфекцию, крови специально иммунизированных доноров

 

Интерфероны как ф-рыпртивовирим-та: ИФ были открыты как противовирагенты.Сущ 3 разновидности:альфа,бета,относимые к первому классу,и гамма(2класс).Альфа продуцируется лейкоцитами.обладпротивовир,антипролиферативным и противоопухолевым действием.Бетта образ фибробластами,обладпротивооп,а также антивирдействием.Гамма-продукт Т-хелперных,а также СД8 Тл-именуется лимфоцитарным и иммунным.Облад иммуномодулирующим и слабым противовирусным эффектом.Продукцию ИФ 1 класса индуцируют вирусы и препараты двунитчатойДНК,продукцию гамма-Ag и митогенныепреп-ты.Потивовир эффект обусловлен спос-ю активировать в кл синтез ингибиторов и ферм-в,блокирующих репликацию вирусной ДНК и РНК,что приводит к подавлению репродукции вируса.Для усиления противовир защиты исп ср-ва,повышающие продукцию собственного ИФ-интерфероногены.В качестве индукторов эндогенного ИФ применяют противовирвакцины,преп-ты РНК и ДНК. По получению: лейкоцитарный чкловеческий.Получ из лейк-в и лимф-в,форма выпуска сухой порошок,развод кипяченой водой и вводят интраназальною.Рекомбинантныйифн-гены из лимф,м/ф,лейк-в вырезают, присоединяют к дефектным фагам,ихисп как вектор.Мвып в форме свечей:роферон, реоферон.Данные препараты эффективнее.