Простые и сложные методы окраски. Протравы, дифференцирующие вещества. Окраска по Цилю-Нильсену.

простые методы окраски - одноэтапные с использованием 1 красителя. препарат фиксируют в пламени горелки, проведя предм. стекло 3 раза через него, окрашивают бумажкой с красителем (добавляя на нее воду и оставляя на 3-5 мин), промывают, высушивают, микроскопируют в иммерсионной системе. красители: фуксин, эозин, метиленовый синий, генцианвиолет.

сложные методы окраски - осуществляются в неск. этапов, препарат красится неск. красителями, используют протравы и диффиренцирующие вещества.

протравы - хим. и физические вещества, повышающие окрашиваемость м/о. Уплотняют цитопл. и делают окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку. (р-р люголя в мет. Гр., HCl в мет.Ожешко, фенол и выс. темп-ра в мет. Циля-Нильсена)

дифференцирующие в-ва: избирательно обесвечивают один вид м/о или опред. анат. структуру. (спирт в мет. Гр., серн.к-та в мет. Циля-Нильсена и Ожешко)

Сложные методы окраски подразделяются на дифференциальные(позв. отличить один вид м/о от другого - ме. Гр. и Циля-Нильсена) и методы, позволяющие выявить анат. структ. м/о (споры - Ожешко, клет. ст. - мет. Пешкова, капс. - мет. Бурри-Гинса, зерна волютина - Нейссера мет.)

Метод Циля-Нильсена: дифференциальный сложный мет.окр. Позволяет отл. кислотоустойчивые м/о от некислотоустойчивых.

1. в пламени горелки фиксируют препарат.

на белую фильтровальную бумажку наливают фуксин Циля (карболовый р-р фуксина) и проводят в пламени горелки 3-4раза до появления белых паров.

2. снимают бумажку, остужают препарат, промывают водой.

3. проводят дифференциацию 5% серной кислотой (опускают препарат в нее 2-3 раза)

4. промывают водой

5. без бумажки наливают р-р метинового синего (5 мин)

6. промывают водой, сушат, микроскопируют в имерсионной среде.

на препарате видно красные кислотоустойчивые бактерии и синие некислотоустойчивые бактерии на голубом фоне среды (мокроты нп., если окрашивали ее ради вывления туберкулезной палочки)

2) Конъюгация. Половой F-фактор, его свойства. F+ и Hfr штаммы. Этапы конъюгации, ее значение.

Конъюгация бактерий состоит в переходе генети­ческого материала (ДНК) из клетки-донора («мужской») в клет­ку-реципиент («женскую») при контакте клеток между собой.

Мужская клетка содержит F-фактор, или половой фактор, который контролирует синтез так называемых половых пилей, или F-пилей. Клетки, не содержа­щие F-фактора, являются женскими; при получении F-фактора они превращаются в «мужские» и сами становятся донорами. F-фактор располагается в цитоплазме в виде кольцевой двунитчатой молекулы ДНК, т. е. является плазмидой. Молекула F-фак­тора значительно меньше хромосомы и содержит гены, контро­лирующие процесс конъюгации, в том числе синтез F-пилей. При конъюгации F-пили соединяют «мужскую» и «женскую» клетки, обеспечивая переход ДНК через конъюгационный мостик или F-пили. Клетки, содержащие F-фактор в цитоплазме, обозначаются F⁺; они передают F-фактор клеткам, обозначае­мым F" («женским»), не утрачивая донорской способности, так как оставляют копии F-фактора. Если F-фактор включается в хромосому, то бактерии приобретают способность передавать фрагменты хромосомной ДНК и называются Hfr-клетками (от англ. high frequency of recombination — высокая частота реком­бинаций), т.е. бактериями с высокой частотой рекомбинаций. При конъюгации клеток Hfr и клеток F" хромосома разрывается и передается с определенного участка (начальной точки) в клет­ку F", продолжая реплицироваться. Перенос всей хромосомы может длиться до 100 мин.

Переносимая ДНК взаимодействует с ДНК реципиента — происходит гомологичная рекомбинация. Прерывая процесс конъ­югации бактерий, можно определять последовательность распо­ложения генов в хромосоме. Иногда F-фактор может при выхо­де из хромосомы захватывать небольшую ее часть, образуя так называемый замещенный фактор — F'.

При конъюгации происходит только частичный перенос ге­нетического материала, поэтому ее не следует отождествлять пол­ностью с половым процессом у других организмов.

 

Билет 18