Тема заняття 6. Дослідження обміну речовин і енергії. Функціонування, регуляція реакцій циклу трикарбонових кислот.

Цілі заняття:

Ø Трактувати біохімічні закономірності протікання обміну речовин: катаболічні, анаболічні, амфіболічні шляхи метаболізму.

Ø Пояснювати біохімічні механізми регуляції процесів анаболізму та катаболізму.

Ø Трактувати біохімічні закономірності функціонування циклу трикарбованих кислот, його анаплеротичні реакції та амфіболічну сутність.

Ø Пояснювати біохімічні механізми регуляції циклу трикарбонових кислот та його ключову роль в обміні речовин та енергії.

 

Теоретичні питання для самопідготовки до заняття:

1. Загальні закономірності обміну речовин; катаболічні, анаболічні, та амфіболічні шляхи метаболізму.

2. Екзергонічні та ендергонічні біохімічні реакції; роль АТФ та інших макроергічних фосфатів у їх спряженні.

3. Внутрішньоклітинна локалізація ферментів та метаболічних шляхів, компартменталізація метаболічних процесів в клітині.

4. Основні стадії катаболізму біомолекул: білків, вуглеводів, ліпідів.

5. Спільні проміжні продукти катаболізму білків, вуглеводів, ліпідів; їх роль в інтеграції метаболізму клітини.

6. Цикл трикарбонових кислот:

· внутрішньоклітинна локалізація ферментів ЦТК;

· послідовність реакцій ЦТК;

· ферменти та коферменти ЦТК;

· реакції субстратного фосфорилювання в ЦТК;

· ферменти та коферменти дегідрогеназних реакцій в ЦТК;

· механізми інгібування ЦТК фторацетатом та малонатом.

7. Енергетичний баланс циклу трикарбонових кислот.

8. Анаплеротичні та амфіболічні реакції ЦТК.

9. Механізми регуляції циклу трикарбонових кислот.

 

 

Практична робота

Завдання 1. Дослідити функціонування циклу трикарбонових кислот мітохондрій за швидкістю використання ацетил-S-КоА та інгібуючий вплив малонової кислоти на цей процес.

Принцип методу.

Клітини м’язової тканини містять велику кількість спеціалізованих субклітинних органел – мітохондрій. Саме в мітохондріях протікають реакції циклу трикарбонових кислот (ЦТК), тканинного дихання та окисного фосфорилювання. Ферменти ЦТК локалізовані в матриксі мітохондрій, компоненти дихального ланцюга вбудовані у внутрішню мембрану мітохондрій.

Перша реакція в ЦТК – це реакція конденсації ацетил-S-КоА з оксалоацетатом. В результаті реакції утворюється цитрат (лимонна кислота), яка піддається подальшому перетворенню в ЦТК. В ході реакції використовується ацетил-S-КоА та вивільняється HS-КоА. Вивільнений НS-КоА виявляють за допомогою реактиву Фоліна-Мазензі (з’являється синє забарвлення).

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), то ацетил-S-КоА не використовується і НS-КоА не вивільняється. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (янтарної кислоти).

Хід роботи. Дві пробірки – контрольну та дослідну заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Пробірки
Контрольна	Дослідна
Фосфатний буфер, рН = 7,4	2,0 мл	2,0 мл
Піровиноградна кислота (джерело утворення ацетил-S-КоА)	1,0 мл	1,0 мл
Малонова кислота	1,0 мл	---
Фізіологічний розчин №1	---	1,0 мл
Суспензія мітохондрій	1,0 мл	1,0 мл
Інкубація в термостаті: 15 хв. при температурі 37^оС
Реактив Фоліна-Мазензі	1,0 мл	1,0 мл
Результати: через 15 хвилин порівняти інтенсивність забарвлення

Через 15 хвилин після додавання реактиву Фоліна-Мазензі порівнюють інтенсивність забарвлення розчину в контрольній і дослідній пробірках.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Завдання 2. Дослідити функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення СО₂ та вплив малонової кислота на цей процес.

Принцип методу. Перетворення ацетил-S-КоА в присутності мітохондрій, що містять ферменти ЦТК, супроводжується утворенням СО₂. В якості джерела ацетил-S-КоА, що вступає в ЦТК, використовують піровиноградну кислоту (ПВК). ПВК під дією мультиферментного піруват-дегідрогеназного комплексу мітохондрій піддається окисному декарбоксилуванню з утворенням ацетил-S-КоА.

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), то СО₂ не утворюється і бульбашки газу не виділяються. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (янтарної кислоти).

Для зв’язування СО₂, що утворюється, в інкубаційне середовище додають Са(ОН)₂. Після закінчення інкубації, зв’язаний СО₂ визначають по виділенню бульбашок газу, що утворюються після додавання до інкубаційного середовища сірчаної кислоти.

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Пробірки
Контроль	Дослід №1	Дослід №2
Фосфатний буфер, рН = 7,4	2,0 мл	2,0 мл	2,0 мл
Розчин пірувату натрію	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Малонова кислота	---	---	0,5 мл
Фізіологічний розчин №2	0,5 мл	0,5 мл	---
Розчин Са(ОН)2	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Суспензія мітохондрій	---	0,5 мл	0,5 мл
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння	0,5 мл	---	---
Інкубація в термостаті: 15 хв. при температурі 37^оС
0,1 М розчин H2SO4	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл
Результати: виділення бульбашок СО2

Всі пробірки поміщають в термостат на 15 хв. при 37^оС. Після інкубації в кожну пробірку додають по 1,0мл 0,1М розчину H₂SO₄ і спостерігають за вивільненням бульбашок СО₂.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Завдання 3. Дослідити функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення атомів водню та вплив малонової кислоти на цей процес.

Принцип методу. При окисленні ацетил-S-КоА в ЦТК вивільняється водень, який відновлює метиленовий синій та перетворює її в безбарвну лейкосполуку. Час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину, є показником інтенсивності протікання ЦТК в мітохондріях.

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), вивільнення водню не відбувається і метиленіий синій не знебарвлюється. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (янтарної кислоти).

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну №1 та дослідну №2 заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Пробірки
Контроль	Дослід №1	Дослід №2
Фосфатний буфер, рН = 7,4	2,0 мл	2,0 мл	2,0 мл
Розчин пірувату натрію	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Малонова кислота	---	---	0,5 мл
Фізіологічний розчин №2	0,5 мл	0,5 мл	---
Суспензія мітохондрій	---	0,5 мл	0,5 мл
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння	0,5 мл	---	---
Метиленовий синій	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Інкубація в термостаті при температурі 37^оС
Результати: час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину

Після додавання метиленового синього всі пробірки поміщають в термостат при 37^оС і відмічають час, протягом якого відбулося знебарвлення розчину в кожній пробірці.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

 

 

Тема №7. Дослідження біологічного окислення, окисного фосфорилювання та синтезу АТФ. Засвоєння принципів хеміосмотичної теорії, аналіз механізму дії інгібіторів та роз'єднувачів окисного фосфорилювання.

Ø Пояснювати процеси біологічного окислення субстратів в клітинах та запасання енергії, що вивільняється, у вигляді макроергічних зв’язків АТФ;

Ø Пояснювати структурну організацію ланцюга транспорту електронів та його молекулярних комплексів;

Ø Пояснювати механізми спряження біологічного окислення та окисного фосфорилювання - синтезу АТФ;

Ø Пояснювати основні засади хеміоосмотичної теорії окисного фосфорилювання;

Ø Аналізувати дію інгібіторів і роз’єднувачів окисного фосфорилювання природного та синтетичного походження, їх фізіологічне значення.

 

Теоретичні питання

 

1. Біологічне окислення субстратів в клітинах:

· окислювально-відновлювальні процеси в живих організмах;

· окислювально-відновлювальний потенціал редокс-пар (характеристика системи, яка віддає або приймає електрони);

2. Реакції біологічного окислення та їх функціональне значення:

· дегідрогеназні;

· оксидазні;

· оксигеназні (моно- та диоксигеназні).

3. Ферменти біологічного окислення, особливості протікання реакцій за їх участю:

· НАД(Ф) – залежні дегідрогенази;

· флавін залежні дегідрогенази;

· цитохроми.

4. Молекулярна організація ланцюга транспорту електронів (дихального ланцюга) мітохондрій:

· компоненти дихального ланцюга мітохондрій;

· послідовність переносників електронів в дихальному ланцюгу;

· рушійна сила векторного руху електронів в дихальному ланцюгу.

5. Надмолекулярні комплекси дихального ланцюга внутрішніх мембран мітохондрій:

· НАДН-коензим Q-редуктаза;

· сукцинат-коензим Q-редуктаза;

· коензим Q-цитохром с-редуктаза;

· цитохром с-оксидаза.

6. Окисне фосфорилювання і синтез АТФ в мітохондріях:

· шляхи утворення АТФ в клітинах – субстратне та окисне фосфорилювання;

· спряження процесів біологічного окислення та окисного фосфорилювання;

· ділянки утворення АТФ в дихальному ланцюзі;

· коефіцієнт окисного фосфорилювання, його значення при окисленні різних субстратів у мітохондріях;

· пункти спряження транспорту електронів та окисного фосфорилювання.

7. Хеміосмотична теорія окисного фосфорилювання, її унікальність та с принципів генерації енергії в різних живих системах.

8. Структурно-функціональні передумови ефективного спряження транспорту електронів в дихальному ланцюгу та синтезу АТФ:

· специфічна асиметрична локалізація компонентів ланцюга транспорту електронів у внутрішній мембрані мітохондрій;

· цілісність спрягаючих мембран мітохондрій та генерація електрохімічного градієнта протонів на мембрані;

· функціонування протонних помп дихального ланцюга;

· АТФ-синтетаза – фермент, що використовує енергію електрохімічного градієнта протонів для синтезу АТФ.

9. Схема хеміосмотичного механізму спряження транспорту електронів в дихальному ланцюгу з синтезом АТФ (молекулярна будова та принцип дії АТФ-синтетази).

10. Інгібітори транспорту електронів та окисного фосфорилювання в дихальному ланцюгу мітохондрій.

11. Роз’єднувачі транспорту електронів та окисного фосфорилювання в дихальному ланцюгу мітохондрій.

12. Фізіологічно активні сполуки – роз’єднувачі транспорту електронів та окисного фосфорилювання в дихальному ланцюгу мітохондрій.

13. Роль роз’єднувачів транспорту електронів та окисного фосфорилювання у регуляції термогенезу в організмі людини і тварин.

 

Практична робота

Завдання 1. Визначення активності ФАД-залежної сукцинат-дегідрогенази – компонента дихального ланцюга мітохондрій.

Принцип методу. Сукцинатдегідрогеназа каталізує дегідрогенізацію сукцинату (янтарної кислоти), в результаті чого утворюється фумарат (фумарова кислота). Кофактором ферменту є ФАД, який відновлюється в процесі реакції до ФАДН₂. Утворений в реакції ФАДН₂ відновлює метиленовий синій та перетворює її в безбарвну лейкосполуку.

Хід роботи. Дві пробірки – контрольну та дослідну заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Пробірка
Контрольна	Дослідна
Фосфатний буфер, рН = 7,4	1,0 мл	1,0 мл
Розчин янтарної кислоти	1,0 мл	1,0 мл
Суспензія мітохондрій	---	0,5 мл
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння	0,5 мл	---
Метиленовий синій	0,5 мл	0,5 мл
Інкубація в термостаті при 37^оС
Результати: час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Завдання 2. Визначення активності цитохромоксидази– компонента дихального ланцюга мітохондрій.

Принцип методу. Цитохроми – складні білки гемпротеїни, відносяться до класу ферментів– оксидо-редуктаз, присутні у всіх тваринних та рослинних клітинах. Завдяки тому, що атоми заліза в цитохромах легко змінюють свою валентність, цитохроми є компонентами дихального ланцюга мітохондрій та переносниками електронів від відновленого убіхінону на кисень. В цитохромній системі передавати електрони на кисень може лише цитохром а-а₃ – цитохромоксидаза в склад якої входить мідь.

Метод визначення активності цитохромоксидази ґрунтується на здатності диметилпарафенілендіамінхлориду (ДПФД) бути донором електронів для цитохрому с. ДПФД неферментативно відновлює цитохром с, а сам окислюючись, перетворюється на червоний пігмент, кількісне утворення якого є пропорційним активності цитохромоксидази мітохондрій.

Хід роботи. Дві пробірки: контрольну та дослідну заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Пробірка
Контрольна	Дослідна
Фосфатний буфер, рН = 7,4	1,0 мл	1,0 мл
Розчин цитохрому с	2 краплі	2 краплі
Суспензія мітохондрій	0,5 мл	0,5 мл
Розчин ДПФД	0,5 мл	0,5 мл
Етиловий спирт	1,0 мл	---
Фізіологічний розчин	---	1,0 мл
Інкубація в термостаті 5 хв. при 37^оС
Результати: поява червоного забарвлення

Додавання етилового спирту інактивує цитохромоксидазу та ферментативне перетворення цитохрому с.

Пробірки поміщають в термостат на 5 хвилин при 37^оС і спостерігають за появою червоного забарвлення.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Частина 2

Завдання 1. Вивчення окисного фосфорилювання в мітохондріях та дії роз’єднувача – 2,4-динітрофенолу на цей процес.

Принцип методу. В процесі окислення різних субстратів і передачі електронів в дихальному ланцюгу мітохондрій вивільняється енергія. Частина цієї енергії використовується для синтезу АТФ в процесі окисного фосфорилювання:

АДФ + Ф_н ® АТФ

В експерименті, щоб запобігти нагромадженню АТФ (високий вміст АТФ інгібує ферменти дихального ланцюга) в якості кінцевого акцептора неорганічного фосфату використовують глюкозу. Фосфорилювання глюкози за участю АТФ каталізує фермент – гексокіназа:

Глюкоза + АТФ ® АДФ + глюкозо-6-фосфат

Визначення неорганічного фосфату ґрунтується на здатності молібдату амонію в кислому середовищі приєднувати залишок фосфорної кислоти з утворенням фосфату амонію. Фосфат амонію під дією відновника – аскорбінової кислоти утворює продукти забарвлені в синій колір. В процесі окисного фосфорилювання Ф_н вилучається з інкубаційного середовища, а тому інтенсивність синього забарвлення розчину зменшується.

Роз’єднувачі – це сполуки які порушують спряженість окислення і фосфорилювання в мітохондріях. В присутності роз’єднувачів спостерігається активне поглинання кисню мітохондріями, однак швидкість генерації АТФ – значно зменшується (або відсутня). Згідно з хеміосмотичною теорією, роз’єднувачі спричиняють втрату мембраною електрохімічного протонного потенціалу – рушійної сили генерації макроергічних зв’язків АТФ.

Хід роботи. Три пробірки– контрольну, дослідну №1 та дослідну №2 заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок	Пробірки
Контроль	Дослід №1	Дослід №2
Суміш № 1 (КН2РО4, KCl, MgCl2, КОН рН = 7,4)	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл
Суміш № 2 (водний розчин глюкози з АТФ)	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Гексокіназа	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Сукцинат калію	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
2,4-динітнофенол	---	---	2 краплі
Суспензія мітохондрій	---	0,5 мл	0,5 мл
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння	0,5 мл	---	---
Розчин оцтової кислоти	2 краплі	---	---
Інкубація в термостаті 15 хв. при температурі 37^оС
Розчин ТХО	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл
Молібдат амонію	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Аскорбінова кислота	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Результати: спостерігають за появою синього забарвлення протягом 20 хвилин

Оцтова кислота додається для повноти денатурації білка в контрольній пробірці. Після інкубації в термостаті протягом 15 хв. при 37^оС в кожну пробірку додають по 1,0мл розчину ТХО; по 0,5мл розчину молибдата амонію та по 0,5мл розчину аскорбінової кислоти. Протягом 20 хвилин спостерігають за появою синього забарвлення.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК: