Тема заняття №1. Контроль початкового рівня знань. Засвоєння принципів проведення біохімічних лабораторних досліджень; обгрунтування та клініко-діагностичне значення змін біохімічних показників. 


Мы поможем в написании ваших работ!



ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Тема заняття №1. Контроль початкового рівня знань. Засвоєння принципів проведення біохімічних лабораторних досліджень; обгрунтування та клініко-діагностичне значення змін біохімічних показників.



Тема заняття №1. Контроль початкового рівня знань. Засвоєння принципів проведення біохімічних лабораторних досліджень; обгрунтування та клініко-діагностичне значення змін біохімічних показників.

Цілі заняття:

Ø Аналізувати етапи та закономірності становлення біохімії як фундаментальної медико-біологічної науки та навчальної дисципліни;

Ø Пояснювати принципи і методи біохімічних досліджень функціонального стану організму людини в нормі і при патології;

Ø Використовувати результати біохімічного аналізу для оцінки стану певних етапів обміну речовин

Ø Класифікувати результати біохімічних досліджень та зміни біохімічних показників для діагностики патологічних процесів.

Теоретичні питання:

1. Біохімія як фундаментальна медико-біологічна наука:

• історія розвитку;

• наукові біохімічні школи, значення в системі вищої медичної освіти.

2. Розділи біохімії:

• статична, динамічна, функціональна біохімія;

• медична та клінічна біохімія.

3. Досягнення біохімії, молекулярної біології, біотехнології та генної інженерії у встановленні молекулярних механізмів патогенезу захворювань, діагностиці та лікуванні основних захворювань людини: серцево-судинних, онкологічних, інфекційних, тощо.

4. Мета проведення біохімічних лабораторних досліджень.

5. Критерії оцінки використаних методів лабораторних досліджень.

6. Матеріал для лабораторних діагностичних досліджень.

7. Принципи забору та зберігання матеріалу для лабораторних досліджень.

8. Помилки при проведенні лабораторних досліджень.

9. Основні методи біохімічних досліджень:

• осадження речовин з розчину, висолювання білків;

• спектрофотометрія;

• електрофорез, хроматографія, полярографія.

Практична робота

Завдання 1. Визначення наявності речовини в розчині методом осадження (на прикладі осадження білків з розчину сульфосалициловою кислотою).

Принцип методу. Білки легко осаджуються з водного розчину мінеральними, органічними кислотами і солями важких металів. Денатурація і осадження білків кислотами обумовлені нейтралізацією поверхневого заряду колоїдних частинок білка, руйнуванням гідратаційної оболонки білкових молекул і утворенням комплексних солей білка з кислотами. Важкі метали утворюють стійкі комплекси з SH-групами білків, що викликає зміни структури і розчинності білка. Особливо чутливими реакціями на наявність білка в розчині є осадження трихлороцтовою і сульфосалициловою кислотами (чутливість останньої реакції складає 1: 50000). Крім того, сульфосаліцилова кислота, поряд з високомолекулярними білками, здатна осаджувати низькомолекулярні білки і продукти розпаду білків - поліпептиди і олігопептиди.

Хід роботи. У пробірку наливають 1,0 мл досліджуваного розчину білка і додають 3-5 крапель 20%-го розчину сульфосаліцилової кислоти. Спостерігають утворення осаду білка.

Клініко-діагностичне та практичне значення. Реакції з сульфосалициловою і трихлороцтовою кислотами використовуються для якісного та кількісного визначення білка в сечі.

Здатність білка міцно зв'язувати іони важких металів використовується в клінічній практиці. Білок використовують як протиотруту при отруєннях солями ртуті, свинцю, тощо. При отруєнні солями важких металів хворому дають велику кількість білка (яєчного білка або молока). У шлунку утворюються нерозчинні комплекси металів з білками, внаслідок чого припиняється всмоктування отрут і їх надходження в кров, зменшується інтоксикація і посилюється їх виведення з організму.

Завдання 2. Визначення наявності речовини в розчині за специфічною кольоровою реакцією; на прикладі біуретової реакції визначення пептидного зв'язку в розчині білка після часткового гідролізу (1, 6, 12:00).

Принцип методу. Біуретова реакція - характерна реакція для сполук, що містять у своєму складі не менше двох пептидних зв'язків. Такі сполуки в лужному середовищі утворюють з мідним купоросом комплекс рожево-фіолетового кольору. В утворенні цього комплексу беруть участь пептидні зв'язки в енольній формі.

Біуретова реакція служить доказом наявності пептидних зв'язків в білках і пептидах.

Хід роботи. У пробірку № 1 вносять 1 мл досліджуваного розчину білка, у пробірку № 2 - 1 мл гідролізату білка (1:00), у пробірку № 3 - 1 мл гідролізату білка (6:00.), у пробірку № 4 - 1 мл гідролізату білка (12:00.). У кожну пробірку додають по 5 крапель 10% -го розчину NaOH і по 5 крапель 1% -го розчину сульфату міді (CuSO4). Поява фіолетового забарвлення (біуретова реакція) свідчить про наявність в розчині білка або поліпептидів. Інтенсивність забарвлення змінюється в залежності від часу гідролізу.

На підставі проведеного експерименту зробити висновки виходячи зі змін інтенсивності забарвлення.

Тема заняття №2. Дослідження фізико-хімічних властивостей білків-ферментів. Засвоєння методів виявлення ферментів в біологічних об'єктах.

Цілі заняття:

Ø Трактувати біохімічні закономірності будови та функціонування різних класів ферментів.

Ø На основі розуміння фізико-хімічних властивостей білків-ферментів пояснювати залежність активності ферментів від рН середовища, температури та інших факторів.

Ø Аналізувати активність ферментів плазми крові залежно від їх внутрішньоклітинної та тканинної (органної) локалізації.

Ø Аналізувати методи виявлення активності ферментів з метою їх оптимального застосування в клініко-лабораторному аналізі.

 

Теоретичні питання;

1. Ферменти як біологічні каталізатори реакцій обміну речовин.

2. Фізико-хімічні властивості білків-ферментів: електрохімічні (поверхневий заряд молекули) властивості, розчинність, термодинамічна стабільність білкових молекул-ферментів, осадження, денатурація, взаємодія з лігандами та її функціональне значення.

3. Прості та складні білки-ферменти, простетичні групи складних білків-ферментів (кофактори, коферменти).

4. Будова ферментів: активний, регуляторний (алостеричний) центри.

5. Номенклатура та класифікація ферментів. Типи реакцій, що каталізують окремі класи ферментів.

6. Властивості ферментів:

· залежність активності ферментів від рН середовища;

· залежність активності ферментів від температури.

7. Специфічність ферментів.

8. Внутрішньоклітинна локалізація ферментів.

9. Тканинна (органи) специфічність ферментів.

10. Методи виявлення ферментів в біологічних об’єктах (кров, слина, сеча, окремі тканини).

11.

Практична робота

Завдання 1. Виявлення амілази в слині та в шлунковому соку.

Принцип методу. Амілаза відноситься до класу гідролаз – ферментів, що каталізують розрив хімічних (глікозидних) зв’язків з приєднанням молекули води. Амілаза слини каталізує гідроліз крохмалю через стадію утворення декстринів до дисахариду мальтози, про що свідчить реакція на крохмаль з йодом та реакція Фелінга на мальтозу. Крохмаль утворює з йодом синє забарвлення і не дає забарвлення в реакції Фелінга, оскільки не містить вільних альдегідних груп. Мальтоза містить вільну альдегідну групу, а тому з реактивом Фелінга при нагріванні випадає жовтий (CuOH) або цегляно-червоний (Cu2O) осад.

Хід роботи. В пробірку вносять 1мл розведеної в два рази слини та додають 2мл 1% розчину крохмалю, добре перемішують і ставлять на 15 хвилин в термостат при температурі 37°С. Після цього зміст пробірки ділять на дві частини. В першу пробірку додають 2-3 краплі розчину йоду. До другої пробірки додають 2-3 краплі реактиву Фелінга (зміст пробірки нагріваємо до кипіння). Спостерігаємо за зміною кольору та утворенням осаду.

Аналогічно проводять дослід зі шлунковим соком.

Результати дослідження заносять в таблицю та роблять висновки:

 

Фермент Об’єкт дослідження Субстрат Умови реакції Реакція:
з йодом з реактивом Фелінга
амілаза слина крохмаль   37оС 15 хв.    
амілаза шлунковий сік крохмаль    

ВИСНОВОК:

Завдання 2. Дослідження впливу високих температур на активність a - амілази слини.

Принцип методу. Активність ферментів залежить від температури. Температура, за якої спостерігається максимальна швидкість ферментативної реакції, носить назву – оптимальна температура. При нагріванні до 60-70оС і вище, ферменти втрачають властивості біологічних каталізаторів. Це пояснюється тепловою денатурацією білкової молекули ферменту. При зниженні температури активність ферментів падає, досягаючи мінімального значення при 0оС.

Вплив температури на активність амілази слини проявляється у зміні швидкості розщеплення крохмалю цим ферментом за різних температурних умов. Ступінь розщеплення крохмалю визначають за допомогою реакції з йодом.

Хід роботи. В одну пробірку додають 1мл розведеної в 2 рази слини, в другу– 1мл розведеної слини після попереднього кип’ятіння (протягом 2хв.). В обидві пробірки додають по 2мл 1% розчину крохмалю і ставлять в термостат при t=37°C на 15 хв. Після інкубації в пробірки додають 2-3 краплі йоду. Спостерігаємо за зміною кольору.

Результати дослідження заносять в таблицю та роблять висновки:

 

Фермент Об’єкт дослідження Субстрат Умови реакції Реакція:
з йодом
амілаза слина до кип’ятіння крохмаль   37оС 15 хв.  
амілаза слина після кип’ятіння крохмаль  

 

ВИСНОВОК:

Завдання 3. Вивчення специфічності дії амілази слини та сахарази дріжджів.

Принцип методу. Специфічність дії є однією з найбільш характерних властивостей ферментів і полягає в тому, що кожен фермент діє на певний субстрат чи групу субстратів, які мають подібну структуру. Розрізняють абсолютну, відносну (групову) та стереохімічну специфічність. Висока специфічність ферментів обумовлена їх білковою природою та структурою активного центру.

Амілаза слини розщеплює крохмаль до дисахариду - мальтози і не діє на дисахарид- сахарозу, сахараза розщеплює сахарозу на глюкозу та фруктозу і не діє на крохмаль. Ступінь гідролізу субстратів оцінюють за результатами реакції Фелінга (при нагріванні). Мальтоза містить вільну альдегідну групу, а тому утворює забарвлення з реактивом Фелінга (при нагріванні). Сахароза не містить вільної альдегідної групи, тому не дає реакції з реактивом Фелінга (при нагріванні).

Хід роботи.

1. Специфічність амілази: в пробірки №1 та №2 поміщають по 1мл розведеної в два рази слини. В пробірку №1 додають 2мл 1% розчину крохмалю, в пробірку №2- 2мл 1% розчину сахарози. Обидві пробірки ставлять в термостат при t=37°C на 15 хв. Після закінчення інкубації в обох пробірках проводять реакцію Фелінга (при нагріванні).

2. Специфічність сахарази дріжджів: в пробірки №3 та №4 поміщають по 1мл препарату сахарази дріжджів. В пробірку №3 додають 2мл 1% розчину крохмалю, в пробірку №4- 2мл 1% розчину сахарози. Обидві пробірки ставлять в термостат при t=37°C на 15 хв. Після закінчення інкубації в обох пробірках проводять реакцію Фелінга (при нагріванні).

Результати проведеного експерименту заносять в таблицю та роблять висновки:

№ пробірки Фермент Об’єкт дослідження Субстрат Умови реакції Реакція:
з реактивом Фелінга
  амілаза слина крохмаль 37оС 15 хв.  
  амілаза слина сахароза  
  сахараза дріжджі крохмаль  
  сахараза дріжджі сахароза  

ВИСНОВОК:

Клініко-діагностичне та практичне значення. Амілаза синтезується переважно в слинних та підшлунковій залозах. Підвищення активності амілази в крові спостерігається при панкреатиті, перитоніті, тромбозі судин, внаслідок введення в організм ряду фізіологічно активних сполук, зокрема морфіну, кодеїну, кортикотропіну (АКТГ) та кортизолу. Підвищення активності амілази слинних залоз спостерігається при стоматиті, невралгії лицевого нерва, нирковій недостатності, паркінсонізмі. Зниження активності амілази крові спостерігається при психічних захворюваннях, анацидних порушеннях. Зниження вмісту амілази в слині має місце при гіпосалівації, запаленні слинних залоз, тощо.

Практична робота

Завдання 1. Провести порівняльний аналіз активності холінестерази у різних зразках сироватки крові (титрування розчином NaOH).

Принцип методу. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна псевдохолінестераза, яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін.

Метод виявлення та кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну. Кількість лугу, що пішла на титрування, є мірою активності ферменту.

Хід роботи. Беруть дві пробірки. У першу відміряють 0,5мл сироватки крові №1, у другу– 0,5мл сироватки крові №2. Потім у обидві пробірки з досліджуваними сироватками додають по 2мл 2% розчину ацетилхоліну та інкубують при 37оС 10 хвилин. Після цього додають по 2 краплі фенолфталеїну і титрують вміст пробірок 0,1М розчином NaOH до слабо рожевого забарвлення.

Кількість лугу, що пішла на титрування, є мірою активності ферменту.

Заповнюють таблицю:

 

Досліджувана сироватка Кількість 0,1М NaOH, що пішла на титрування, в мл Висновок
№ 1    
№ 2    

За результатами проведеного експерименту зробити висновок.

ВИСНОВОК:

Клініко-діагностичне значення. Визначення активності холінестерази сироватки крові використовується для діагностики ряду захворювань, зокрема інфаркту міокарда, вірусного гепатиту, злоякісних пухлин печінки, тощо. Перераховані захворювання супроводжуються значним зниженням активності холінестерази сироватки крові.

У норміактивність холінестеразив сироватці крові становить 44,4 – 94,4 мккат/л (колориметричним методом за гідролізом ацетилхолінхлориду).

Фізіологічно активні сполуки, що є інгібіторами ацетилхолінестерази, мають важливе фармакологічне та токсикологічне значення, оскільки спричиняють значне підвищення концентрації нейромедіатора як в структурах центральної нервової системи, так і в організмі в цілому.

Зворотні інгібітори ацетилхолінестерази застосовуються в медицині з метою збільшення активності холінергічної імпульсації, порушеної при певних неврологічних захворюваннях, таких як атонія кишківника, сечового міхура. Із зазначеною метою застосовуються препарати: Прозерин, Фізостигмін, Галантамін.

Незворотні інгібіториацетилхолінестерази є потужними нервовими отрутами, які спричиняють різке збудження нервової системи із судомами, порушенням функції серцево-судинної, гастро-інтестинальної та інших фізіологічних систем організму. Найбільш поширеними незворотними інгібіторами є фосфорорганічні сполуки – ФОС. В сільському господарстві для боротьби зі шкідливими комахами використовують: хлорофос, дихлофос, метафос, карбофос, тощо. Нервово-паралітичними отрутами, що використовуються як бойові отруйні речовини є табун, зарин, зоман, тощо.

Висока чутливість холінестерази до дії фосфорорганічних сполук робить її специфічним біохімічним маркером для виявлення впливу цих отрут на організм людини.

Завдання 2. Дослідити вплив фосфаколу та іонів кальцію на активність холінестерази.

Принцип методу. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу нейромедіатора – ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна псевдохолінестераза, яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін.

Фосфорорганічні сполуки (ФОС, фосфакол) є незворотними інгібіторами холінестерази та ацетилхолінестерази, оскільки ковалентно зв’язуються з активним центром ферменту і гальмують його активність. Препарати ФОС є високотоксичними отрутами для комах (пестициди) та теплокровних тварин. Механізм гальмівної дії полягає у зв’язуванні з ОН-групою серину в активному центрі ферменту.

Зростання концентрації іонів Са2+ в нервовому закінченні є безпосереднім біохімічним сигналом, що активує вихід ацетилхоліну через пресинаптичну мембрану, його взаємодію з холінорецепторами постсинаптичної мембрани та розщеплення медіатора в синоптичній щілині ацетилхолінестеразою. Тому іони кальцію є потужним активатором холінестерази.

Метод кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну.

Кількість лугу, що пішла на титрування є мірою активності ферменту.

Хід роботи. Три пробірки заповнюють реактивами за таблицею.

 

Вміст пробірок № пробірки
     
Сироватка крові, мл 0,5 0,5 0,5
Розчин CaCl2, крапель ---   ---
Розчин фосфаколу, крапель --- ---  
Інкубація при кімнатній температурі, 5 хвилин
Розчин ацетилхоліну –2%, мл 1,5 1,5 1,5
Інкубація 10 хвилин
Фенолфталеїн, крапель      
Кількість 0,1М NaOH, що пішла на титрування      

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Клініко-діагностичне та практичне значення. Фізіологічно активні сполуки, що є інгібіторами ацетилхолінестерази, мають важливе фармакологічне та токсикологічне значення, оскільки спричиняють значне підвищення концентрації нейромедіатора як в структурах центральної нервової системи, так і в організмі в цілому.

Зворотні інгібітори ацетилхолінестерази застосовуються в медицині з метою збільшення активності холінергічної імпульсації, порушеної при певних неврологічних захворюваннях, таких як атонія кишечника, сечового міхура. Із зазначеною метою застосовуються препарати: Прозерин, Фізостигмін, Галантамін.

Незворотні інгібітори ацетилхолінестерази є потужними нервовими отрутами, які спричиняють різке збудження нервової системи із судомами, порушенням функції серцево-судинної, гастро-інтестинальної та інших фізіологічних систем організму. Найбільш поширеними незворотними інгібіторами є фосфорорганічні сполуки– ФОС. В сільському господарстві для боротьби зі шкідливими комахами використовують: хлорофос, дихлофос, метафос, карбофос, тощо. Нервово-паралітичними отрутами, що використовуються як бойові отруйні речовини є табун, зарин, зоман, тощо.

Висока чутливість холінестерази до дії фосфорорганічних сполук робить її специфічним біохімічним маркером для виявлення впливу цих отрут на організм людини.

 

Практична робота

Завдання 1. Визначення вмісту аскорбінової кислоти в сечі та плазмі крові як показник забезпеченості організму вітаміном С.

Для оцінки С-вітамінної забезпеченості організму найбільше поширення отримали прямі методи визначення аскорбінової кислоти в крові і сечі. Концентрація вітаміну в плазмі крові і виведення його з сечею знаходяться в тісному зв’язку і є показником забезпеченості харчового раціону вітаміном С.

Практична робота

Завдання 1. Виявлення жиророзчинних вітамінів.

Практична робота

Завдання 1. Дослідити функціонування циклу трикарбонових кислот мітохондрій за швидкістю використання ацетил-S-КоА та інгібуючий вплив малонової кислоти на цей процес.

Принцип методу.

Клітини м’язової тканини містять велику кількість спеціалізованих субклітинних органел – мітохондрій. Саме в мітохондріях протікають реакції циклу трикарбонових кислот (ЦТК), тканинного дихання та окисного фосфорилювання. Ферменти ЦТК локалізовані в матриксі мітохондрій, компоненти дихального ланцюга вбудовані у внутрішню мембрану мітохондрій.

Перша реакція в ЦТК – це реакція конденсації ацетил-S-КоА з оксалоацетатом. В результаті реакції утворюється цитрат (лимонна кислота), яка піддається подальшому перетворенню в ЦТК. В ході реакції використовується ацетил-S-КоА та вивільняється HS-КоА. Вивільнений НS-КоА виявляють за допомогою реактиву Фоліна-Мазензі (з’являється синє забарвлення).

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), то ацетил-S-КоА не використовується і НS-КоА не вивільняється. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (янтарної кислоти).

Хід роботи. Дві пробірки – контрольну та дослідну заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок Пробірки
Контрольна Дослідна
Фосфатний буфер, рН = 7,4 2,0 мл 2,0 мл
Піровиноградна кислота (джерело утворення ацетил-S-КоА) 1,0 мл 1,0 мл
Малонова кислота 1,0 мл ---
Фізіологічний розчин №1 --- 1,0 мл
Суспензія мітохондрій 1,0 мл 1,0 мл
Інкубація в термостаті: 15 хв. при температурі 37оС
Реактив Фоліна-Мазензі 1,0 мл 1,0 мл
Результати: через 15 хвилин порівняти інтенсивність забарвлення    

Через 15 хвилин після додавання реактиву Фоліна-Мазензі порівнюють інтенсивність забарвлення розчину в контрольній і дослідній пробірках.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Завдання 2. Дослідити функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення СО2 та вплив малонової кислота на цей процес.

Принцип методу. Перетворення ацетил-S-КоА в присутності мітохондрій, що містять ферменти ЦТК, супроводжується утворенням СО2. В якості джерела ацетил-S-КоА, що вступає в ЦТК, використовують піровиноградну кислоту (ПВК). ПВК під дією мультиферментного піруват-дегідрогеназного комплексу мітохондрій піддається окисному декарбоксилуванню з утворенням ацетил-S-КоА.

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), то СО2 не утворюється і бульбашки газу не виділяються. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (янтарної кислоти).

Для зв’язування СО2, що утворюється, в інкубаційне середовище додають Са(ОН)2. Після закінчення інкубації, зв’язаний СО2 визначають по виділенню бульбашок газу, що утворюються після додавання до інкубаційного середовища сірчаної кислоти.

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок Пробірки
Контроль Дослід №1 Дослід №2
Фосфатний буфер, рН = 7,4 2,0 мл 2,0 мл 2,0 мл
Розчин пірувату натрію 0,5 мл 0,5 мл 0,5 мл
Малонова кислота --- --- 0,5 мл
Фізіологічний розчин №2 0,5 мл 0,5 мл ---
Розчин Са(ОН)2 0,5 мл 0,5 мл 0,5 мл
Суспензія мітохондрій --- 0,5 мл 0,5 мл
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння 0,5 мл --- ---
Інкубація в термостаті: 15 хв. при температурі 37оС
0,1 М розчин H2SO4 1,0 мл 1,0 мл 1,0 мл
Результати: виділення бульбашок СО2        

Всі пробірки поміщають в термостат на 15 хв. при 37оС. Після інкубації в кожну пробірку додають по 1,0мл 0,1М розчину H2SO4 і спостерігають за вивільненням бульбашок СО2.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Завдання 3. Дослідити функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення атомів водню та вплив малонової кислоти на цей процес.

Принцип методу. При окисленні ацетил-S-КоА в ЦТК вивільняється водень, який відновлює метиленовий синій та перетворює її в безбарвну лейкосполуку. Час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину, є показником інтенсивності протікання ЦТК в мітохондріях.

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), вивільнення водню не відбувається і метиленіий синій не знебарвлюється. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (янтарної кислоти).

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну №1 та дослідну №2 заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок Пробірки
Контроль Дослід №1 Дослід №2
Фосфатний буфер, рН = 7,4 2,0 мл 2,0 мл 2,0 мл
Розчин пірувату натрію 0,5 мл 0,5 мл 0,5 мл
Малонова кислота --- --- 0,5 мл
Фізіологічний розчин №2 0,5 мл 0,5 мл ---
Суспензія мітохондрій --- 0,5 мл 0,5 мл
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння 0,5 мл --- ---
Метиленовий синій 0,5 мл 0,5 мл 0,5 мл
Інкубація в термостаті при температурі 37оС
Результати: час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину        

Після додавання метиленового синього всі пробірки поміщають в термостат при 37оС і відмічають час, протягом якого відбулося знебарвлення розчину в кожній пробірці.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

 

 

Тема №7. Дослідження біологічного окислення, окисного фосфорилювання та синтезу АТФ. Засвоєння принципів хеміосмотичної теорії, аналіз механізму дії інгібіторів та роз'єднувачів окисного фосфорилювання.

Ø Пояснювати процеси біологічного окислення субстратів в клітинах та запасання енергії, що вивільняється, у вигляді макроергічних зв’язків АТФ;

Ø Пояснювати структурну організацію ланцюга транспорту електронів та його молекулярних комплексів;

Ø Пояснювати механізми спряження біологічного окислення та окисного фосфорилювання - синтезу АТФ;

Ø Пояснювати основні засади хеміоосмотичної теорії окисного фосфорилювання;

Ø Аналізувати дію інгібіторів і роз’єднувачів окисного фосфорилювання природного та синтетичного походження, їх фізіологічне значення.

 

Теоретичні питання

 

1. Біологічне окислення субстратів в клітинах:

· окислювально-відновлювальні процеси в живих організмах;

· окислювально-відновлювальний потенціал редокс-пар (характеристика системи, яка віддає або приймає електрони);

2. Реакції біологічного окислення та їх функціональне значення:

· дегідрогеназні;

· оксидазні;

· оксигеназні (моно- та диоксигеназні).

3. Ферменти біологічного окислення, особливості протікання реакцій за їх участю:

· НАД(Ф) – залежні дегідрогенази;

· флавін залежні дегідрогенази;

· цитохроми.

4. Молекулярна організація ланцюга транспорту електронів (дихального ланцюга) мітохондрій:

· компоненти дихального ланцюга мітохондрій;

· послідовність переносників електронів в дихальному ланцюгу;

· рушійна сила векторного руху електронів в дихальному ланцюгу.

5. Надмолекулярні комплекси дихального ланцюга внутрішніх мембран мітохондрій:

· НАДН-коензим Q-редуктаза;

· сукцинат-коензим Q-редуктаза;

· коензим Q-цитохром с-редуктаза;

· цитохром с-оксидаза.

6. Окисне фосфорилювання і синтез АТФ в мітохондріях:

· шляхи утворення АТФ в клітинах – субстратне та окисне фосфорилювання;

· спряження процесів біологічного окислення та окисного фосфорилювання;

· ділянки утворення АТФ в дихальному ланцюзі;

· коефіцієнт окисного фосфорилювання, його значення при окисленні різних субстратів у мітохондріях;

· пункти спряження транспорту електронів та окисного фосфорилювання.

7. Хеміосмотична теорія окисного фосфорилювання, її унікальність та с принципів генерації енергії в різних живих системах.

8. Структурно-функціональні передумови ефективного спряження транспорту електронів в дихальному ланцюгу та синтезу АТФ:

· специфічна асиметрична локалізація компонентів ланцюга транспорту електронів у внутрішній мембрані мітохондрій;

· цілісність спрягаючих мембран мітохондрій та генерація електрохімічного градієнта протонів на мембрані;

· функціонування протонних помп дихального ланцюга;

· АТФ-синтетаза – фермент, що використовує енергію електрохімічного градієнта протонів для синтезу АТФ.

9. Схема хеміосмотичного механізму спряження транспорту електронів в дихальному ланцюгу з синтезом АТФ (молекулярна будова та принцип дії АТФ-синтетази).

10. Інгібітори транспорту електронів та окисного фосфорилювання в дихальному ланцюгу мітохондрій.

11. Роз’єднувачі транспорту електронів та окисного фосфорилювання в дихальному ланцюгу мітохондрій.

12. Фізіологічно активні сполуки – роз’єднувачі транспорту електронів та окисного фосфорилювання в дихальному ланцюгу мітохондрій.

13. Роль роз’єднувачів транспорту електронів та окисного фосфорилювання у регуляції термогенезу в організмі людини і тварин.

 

Практична робота

Завдання 1. Визначення активності ФАД-залежної сукцинат-дегідрогенази – компонента дихального ланцюга мітохондрій.

Принцип методу. Сукцинатдегідрогеназа каталізує дегідрогенізацію сукцинату (янтарної кислоти), в результаті чого утворюється фумарат (фумарова кислота). Кофактором ферменту є ФАД, який відновлюється в процесі реакції до ФАДН2. Утворений в реакції ФАДН2 відновлює метиленовий синій та перетворює її в безбарвну лейкосполуку.

Хід роботи. Дві пробірки – контрольну та дослідну заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок Пробірка
Контрольна Дослідна
Фосфатний буфер, рН = 7,4 1,0 мл 1,0 мл
Розчин янтарної кислоти 1,0 мл 1,0 мл
Суспензія мітохондрій --- 0,5 мл
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння 0,5 мл ---
Метиленовий синій 0,5 мл 0,5 мл
Інкубація в термостаті при 37оС
Результати: час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину    

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Завдання 2. Визначення активності цитохромоксидази– компонента дихального ланцюга мітохондрій.

Принцип методу. Цитохроми – складні білки гемпротеїни, відносяться до класу ферментів– оксидо-редуктаз, присутні у всіх тваринних та рослинних клітинах. Завдяки тому, що атоми заліза в цитохромах легко змінюють свою валентність, цитохроми є компонентами дихального ланцюга мітохондрій та переносниками електронів від відновленого убіхінону на кисень. В цитохромній системі передавати електрони на кисень може лише цитохром а-а3 цитохромоксидаза в склад якої входить мідь.

Метод визначення активності цитохромоксидази ґрунтується на здатності диметилпарафенілендіамінхлориду (ДПФД) бути донором електронів для цитохрому с. ДПФД неферментативно відновлює цитохром с, а сам окислюючись, перетворюється на червоний пігмент, кількісне утворення якого є пропорційним активності цитохромоксидази мітохондрій.

Хід роботи. Дві пробірки: контрольну та дослідну заповнюють реактивами за таблицею:

Вміст пробірок Пробірка
Контрольна Дослідна
Фосфатний буфер, рН = 7,4 1,0 мл 1,0 мл
Розчин цитохрому с 2 краплі 2 краплі
Суспензія мітохондрій 0,5 мл 0,5 мл
Розчин ДПФД 0,5 мл 0,5 мл
Етиловий спирт 1,0 мл ---
Фізіологічний розчин --- 1,0 мл
Інкубація в термостаті 5 хв. при 37оС
Результати: поява червоного забарвлення    

Додавання етилового спирту інактивує цитохромоксидазу та ферментативне перетворення цитохрому с.

Пробірки поміщають в термостат на 5 хвилин при 37оС і спостерігають за появою червоного забарвлення.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Частина 2

Завдання 1. Вивчення окисного фосфорилювання в мітохондріях та дії роз’єднувача – 2,4-динітрофенолу на цей процес.

Принцип методу. В процесі окислення різних субстратів і передачі електронів в дихальному ланцюгу мітохондрій вивільняється енергія. Частина цієї енергії використовується для синтезу АТФ в процесі окисного фосфорилювання:

АДФ + Фн ® АТФ

В експерименті, щоб запобігти нагромадженню АТФ (високий вміст АТФ інгібує ферменти дихального ланцюга) в якості кінцевого акцептора неорганічного фосфату використовують глюкозу. Фосфорилювання глюкози за участю АТФ каталізує фермент – гексокіназа:

Глюкоза + АТФ ® АДФ + глюкозо-6-фосфат

Визначення неорганічного фосфату ґрунтується на здатності молібдату амонію в кислому середовищі приєднувати залишок фосфорної кислоти з утворенням фосфату амонію. Фосфат амонію під дією відновника – аскорбінової кислоти утворює продукти забарвлені в синій колір. В процесі окисного фосфорилювання Фн вилучається з інкубаційного середовища, а тому інтенсивність синього забарвлення розчину зменшується.

Роз’єднувачі – це сполуки які порушують спряженість окислення і фосфорилювання в мітохондріях. В присутності роз’єднувачів спостерігається активне поглинання кисню мітохондріями, однак швидкість генерації АТФ – значно зменшується (або відсутня). Згідно з хеміосмотичною теорією, роз’єднувачі спричиняють втрату мембраною електрохімічного протонного потенціалу – рушійної сили генерації макроергічних зв’язків АТФ.

Хід роботи. Три пробірки– контрольну, дослідну №1 та дослідну №2 заповнюють реактивами за таблицею:



Поделиться:


Последнее изменение этой страницы: 2016-12-15; просмотров: 154; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.89.56.228 (0.132 с.)