Внимание: соблюдать меры безопасности при работе с кипящей водяной баней.

ХОД РАБОТЫ:

1. Наливают в 4 пробирки по 0,5 мл раствора крахмала. Еще в 4 пробирки наливают по 0,5 мл разбавленной (1:10) слюны.

2. Берут первую пару пробирок (одна с ферментом, другая с крахмалом) и помещают на баню со льдом. Вторую пару оставляют при комнатной температуре. Третью пару пробирок помещают в термостат (40 градусов), а четвертую - в кипящую водяную баню.

3. Через 10 мин содержимое каждой пары пробирок сливают вместе, тщательно перемешивают и оставляют стоять еще 10 мин в тех же условиях.

4. Из 3-й пробирки отбирают 3 капли жидкости и проделывают реакцию с каплей йода на стекле. Если появляется синее окрашивание, растворы оставляют стоять еще 10 мин, и после этого повторяют реакцию с йодом на стекле. Затем добавляют 2 капли раствора йода во все пробирки и наблюдают за появлением окрашивания.

ВЫВОД (записать полученный результат и дать ему клинико-диагностическую оценку):

 

 

Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы.

ХОД РАБОТЫ:

1. В одну пробирку вносят 10 капель дистиллированной воды, а во 2-ю - 8 капель воды и 2 капли 1% раствора хлорида натрия в 3-ю - 8 капель воды и 2 капли раствора сульфата меди.

2. В каждую пробирку добавляют по 20 капель разведенной слюны (1:10), пробирки перемешивают, добавляют по 5 капель раствора крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре 5 мин.

3. Тем временем готовят 3 пробирки с водой (по 1 мл) подкрашенной каплей раствора йода, и добавляют в них по 3 капли содержимого опытных проб. Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления крахмала амилазой. В 1-ой пробирке появляется фиолетовая или красно- бурая окраска, во второй пробирке, где ионы хлора играют роль активатора, появляется желтая окраска, а в 3-ей пробирке, где ионы меди тормозят действие амилазы, окраска остается синей. Если описанная картина не наблюдается, то опыт повторяют через 10-15 минут.

ВЫВОД (записать полученный результат и дать ему клинико-диагностическую оценку):

 

Влияние pH на активность амилазы слюны.

Оптимум pH для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях pH среды. О степени расщепления крахмала можно судить по реакции крахмала с йодом в течение времени. При оптимальном значении pH расщепление крахмала произойдет полностью (окраска с йодом отсутствует). По мере удаления от точки pH в кислую или щелочную сторону произойдет лишь частичное расщепление крахмала до стадии декстринов (красно-бурая или фиолетовая окраска) или крахмал вообще расщепляться не будет (синяя окраска).

ХОД РАБОТЫ:

1. В 4 пронумерованные пробирки отмеривают отдельными пипетками по 2 мл фосфатного буфера с различным значением pH (2,0; 4;0, 6,8; 9,0).

2. В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала и по 0,5 мл разбавленной (1: 10) слюны, которые помещают в термостат на 10 мин при 38° С.

3. Из каждой пробирки каплю жидкости смешивают с каплей раствора йода на предметном стекле и сравнивают окрашивание в каждой пробирке. Повторяют эту пробу через 1-2 мин до тех пор, пока проба из 5 пробирки даст с йодом на стекле красно-бурое окрашивание. Через 1-2 мин после этого во все пробирки добавляют по 2-3 кап раствора йода (начинать с 1 пробирки). Содержимое пробирок хорошо взбалтывают. Сравнивают между собой окрашивание во всех пробирках и делают вывод о степени расщепления крахмала, а, следовательно, об активности фермента при этом значении pH среды.

ВЫВОД (записать полученный результат и дать ему клинико-диагностическую оценку):

 

ЗАНЯТИЕ 4

ТЕМА: Ферменты 3. Номенклатура и классификация ферментов. Медицинская энзимология.

Цель занятия: Сформировать представления о принципах номенклатуры и классификации ферментов, основных аспектах и проблемах медицинской энзимологии. Научиться определять активность амилазы в моче.

Исходный уровень знаний и навыков:

Студент должен знать:

1. Строение клетки и основных органелл

2. Понятие о мутациях и механизмах мутагенеза Основные этапы биосинтеза белка

3. Принципы и методы измерения скорости химических реакций

Студент должен уметь:

1. Выполнять качественные реакции на активность ферментов биологических жидкостей.

Структура занятия:

1. Теоретическаячасть:

1.1. Локализация ферментов в клетке (клеточная мембрана, цитоплазма, митохондрии, ядро, лизосома, рибосомы). Маркерные ферменты. Органоспецифические ферменты. Выделение и очистка ферментов. Качественное обнаружение и количественное определение. Единицы измерения количества и активности ферментов. Номенклатура и классификация.

1.2. Изоферменты, их биологическая роль. Полиферментные комплексы. Понятие о метаболоне.

1.3. Изменение активности ферментов в онтогенезе.

1.4. Основные направления клинической энзимологии.

1.4.1. Энзимопатии. Определение. Классификация. Первичные (наследственные) энзимопатии. Причины возникновения. Механизм развития метаболических нарушений при энзимопатиях. Степень клинических проявлений энзимопатий. Вторичные (приобретенные) - токсические, алиментарные энзимопатии. Причины возникновения. Механизм развития метаболических нарушений. Клинические проявления.

1.4.2. Энзимодиагностика, принципы и объекты энзимодиагностики (кровь, моча, слюна, ликвор, пот, и др.). Характеристика основных ферментов сыворотки крови (клеточные, секреторные и экскреторные). Типы изменения активности ферментов при патологии (гипо-, гипер- и дисферментемия). Задачи энзимодиагностики.

1.4.3. Энзимотерапия. Использование ферментов для заместительной терапии. Лечение хирургических, сердечно- сосудистых и онкологических заболеваний. Иммобилизованные ферменты. Липосомы и их применение.

1.4.4. Использование ферментов в лабораторной практике для определения концентрации субстратов и активности ферментов.

1.4.5. Использование ферментов в промышленности и производстве.

2. Практическая часть (выполнение лабораторной работы):

2.1. Количественное определение активности амилазы мочи по Вольгемуту.

3. Решение задач и проведение контроля конечного уровня

 

Литература основная:

1. 1. Материал лекций

2. Березов Т. Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия, М., Медицина, 1990, стр. 126-132, М., Медицина, 1998, стр. 157-168.

3. 3. Николаев А. Н. Биологическая химия, М., Высшая школа, 1989, стр. 52-92.

дополнительная:

4. 4. Р. Марри и др. "Биохимия человека", М., Мир, 1.1993, том 1, стр. 63-75.

5. 5. Филиппович Ю. Б. "Основы биохимии" М., Высшая школа, 1993, стр. 105-144.

6. 6. Ташев Т (ред.). Врожденные и приобретенные энзимопатии. М., Медицина, 1980.

7. 7. Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. М., Медицина, 1981.

8. 8. Руководство по клинической лабораторной диагностике. Киев, Выща школа, 1990, стр. 167-186

9. 9. Зилва Ф., Пеннел Дж. Клиническая химия в диагностике и лечении. М., Медицина, 1986, стр.372-388.

ЗАДАЧИ

1. Изоферменты ЛДГ различаются по:

а) электрофоретической подвижности	г) субстратной специфичности
б) Km для ПВК
в) числу субъединиц	д) органной локализации

 

2. Какие из свойств ферментов плазмы крови можно использовать с целью диагностики?

а) молекулярную массу и его электрофоретическую подвижность

б) значение K_m для субстратов

в) чувствительность к действию активаторов и ингибиторов, а также к условиям среды.

г) энергию активации

д) оптимум pH

 

3. О каких заболеваниях свидетельствует увеличение активности перечисленных ферментов в плазме крови?

1. АСТ	а) Костные заболевания
2. АЛТ	б) Острый гепатит
3. Щелочная фосфатаза	в) Холестаз
4. Кислая фосфатаза	г) Аденома простаты
5. 5-нуклеотидаза	д) Инфаркт миокарда

 

4. Ингибиторами каких ферментов являются указанные соединения:

1. Диизопропилфторфосфат	а) ДНК-полимераза
2. Парахлормеркурийбензоат	б) Ацетилхолинэстераза
3. Малонат	в) Ферменты с каталитически активной SH-группой
4. Фторурацил	г) цитохромоксидаза
5. Цианид	д) сукцинат-ДГ

 

5. В структуру каких ферментов входят соединения?

1. FAD^+	а) пируваткарбоксилаза
2. пиридоксальфосфат	б) ЛДГ
3. ТПФ (кокарбоксилаза)	в) АСТ
4. биотин	г) оксидаза аминокислот
5. NAD^+	д) ПВК декарбоксилаза

Практическая часть:

Лаборатоpная работа № 1: Количественное определение активности амилазы мочи по Вольгемуту.

ПРИНЦИП МЕТОДА: Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, ликвор, слюна, сыворотка крови) основано на определении минимальной активности (количества) фермента, катализирующего в стандартных условиях гидролиз добавленного крахмала. Амилазная активность мочи выражается количеством мл крахмала, которое расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 45ºC за 15 минут.

ХОД РАБОТЫ: Берут 10 пронумерованных пробирок и приливают в каждую по 1 мл физиологического раствора. Затем в 1-ю пробирку добавляют 1 мл исследуемой мочи. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят во 2-ю пробирку и процедуру повторяют вплоть до 10-й пробирки. Из 10 пробирки 1 мл смеси отбрасывают. При этом получается следующее разведение мочи (см. табл.).

В каждую пробирку добавляют по 1 мл физраствора и по 2 мл 0,1% раствора крахмала. После перемешивания содержимого, пробирки термостатируют 15 мин при температуре 45°С. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой и ставят в штатив по порядку. Прибавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора йода и перемешивают. Отмечают пробирку с наибольшим разведением мочи, при котором произошло полное расщепление крахмала с йодом. Полученные данные заносят в таблицу:

 

№ пробирки
Разведение	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024
Гидролиз крахмала

Расчет: Предположим, что полный гидролиз крахмала произошел в первых 4-х пробирках. В четвертой пробирке (где разведение мочи 1:16), 1/16 мл мочи гидролизует 2 мл 0,1% крахмала, значит 1 мл неразведенной мочи расщепит 32 мл 0,1% крахмала. Следовательно, активность амилазы мочи равна 32 единицы. В норме активность амилазы мочи равна 16-64 единицы.

Клинико-диагностическое значение.

Определение активности амилазы мочи и сыворотки крови широко используется в клинической практике для диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует. В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эндемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита.

ВЫВОД (записать полученный результат и дать ему клинико-диагностическую оценку):

 

ЗАНЯТИЕ 5

ТЕМА: Биологическое окисление 1. Цикл Кребса.

Цель занятия: Сформулировать современные представления о путях и механизмах получения, депонирования и утилизации энергии в живых организмах.

 

Исходный уровень знаний и умений:

Студент должен знать:

1. Элементы химической термодинамики. Первый и второй законы термодинамики. Энергия Гиббса.

2. Суть и механизм окислительно-восстановительных реакций.

3. Строение коферментов NAD⁺, NADP⁺, FAD⁺ их роль и механизм участия в окислительно-восстановительных реакциях.

Студент должен уметь:

1. Выполнять качественные реакции на субстраты энергетического обмена.

Структура занятия:

1. Теоретическая часть:

1.1. История развития учения о биологическом окислении (БО). Взгляды А. Лавуазье, М.В. Ломоносова, Ф. Шейнбайна, А.Н. Баха, К. Энглера, В.И. Палладина, Г. Виланда.

1.2. Теория перекисных соединений Баха - Энглера, ее суть и критический анализ.

1.3. Теория Палладина - Виланда, ее суть и критический анализ.

1.4. Дальнейшее развитие учения о биологическом окислении. Современные представления о биологическом окислении. Принципы преобразования и передачи энергии в живых системах. Окислительно-восстановительные реакции, окислительно-восстановительный потенциал. Макроэргические соединения, строение АТФ, причины макроэргичности.

1.5. Субстраты биологического окисления. Схема образования субстратов из углеводов, липидов, белков. Этапы биологического окисления - цитоплазматический и митохондриальный. Ферменты, коферменты биологического окисления - NAD⁺, NADP⁺, FAD и FMN зависимые дегидрогеназы.

1.6. Строение и функции митохондрии. Сравнительная характеристика мембран митохондрий. Ферментный состав различных компартментов.

1.7. ЦТК - цикл трикарбоновых кислот (Кребса), как общий конечный пункт утилизации субстратов биологического окисления. История открытия. Последовательность реакций, ферменты, коферменты. Субстратное фосфорилирование. Регуляция ЦТК. Значение ЦТК (пластическая, энергетическая и регуляторная роль).

1.8. Витамины PP, B₂. Строение и роль в энергетическом обмене.

 

2. Практическая часть - выполнение лабораторных работ:

2.1. Открытие субстратов ЦТК (лимонной и янтарной кислот).

2.2. Качественное обнаружение цитохромоксидазы.

3. Решение задач и проведение контроля конечного уровня

 

Литература основная:

1. Материал лекций

2. Березов Т. Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия, М., Медицина, 1990, стр. 213-220, М., Медицина, 1998, стр. 223-226, 345-353.

3. Николаев А. Н. Биологическая химия, М., Высшая школа, 1989, стр. 199-221.

дополнительная:

4. 4. Р. Марри и др. "Биохимия человека", М., Мир, 1993, том 1, стр. 111-126, 172-177.

5. 5. Ленинджер А. Основы биохимии, 1985, том 2, стр. 477-507.

ЗАДАЧИ:

 

1. БО у высших организмов сопряжено с:

а) переносом протонов	г) переносом электронов
б) образованием воды	д) прямым потреблением кислорода
в) функцией митохондрий

 

2. В митохондриях:

а) образуются липопротеиды крови	г) синтезируются стероиды
б) протекает гидролиз макромолекул	д) гидролизуются лекарства
в) происходит окислительное фосфорилирование

 

3. Какие из этапов ЦТК обеспечивает наибольший выход АТФ:

а) изоцитрат ¾® малат	г) сукцинат¾® фумарат
б) изоцитрат ¾® a-КГ	д) сукцинат ¾® ЩУК
в) a-КГ ¾® ЩУК

 

4. При окислении 1 г жира образуется больше энергии, чем при распаде углеводов и белков, потому что:

а) липиды образуют большее количество ацетил-КоА, чем необходимо для ЦТК

б) ткани, утилизирующие липиды выделяют больше тепла, чем ткани, утилизирующие углеводы.

в) атомы углерода в липидах "более восстановлены", чем в белках и углеводах.

г) окислительный метаболизм липидов протекает более полно

д) молекулярный вес липидов больше, чем углеводов.

 

5. Какой из следующих биологических процессов потребляет наибольшее количество энергии?

а) анаэробный гликолиз	г) биосинтез белка
б) фиксация углекислого газа	д) аэробное (окислительное) фосфорилирование
в) протеолиз	е) биосинтез липидов

 

6. Какие из указанных соединений являются макроэргическими:

а) фосфокреатин	г) АДФ
б) фосфоенолпируват	д) АТФ
в) АМФ	е) аденозин

Практическая часть:

Лаборатоpная работа № 1. Открытие некоторых субстратов ЦТК (лимонной и янтаpной кислот)

ПРИНЦИП МЕТОДА: Ди- и трикарбоновые кислоты, карбоксильные группы которых расположены рядом при взаимодействии с резорцином и конц. серной кислотой образуют флюоресцирующие в ультрафиолетовом свете продукты.