Третичная структура белков. Представление об изучении пространственного строения пептидов и белков методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса.

 

Полипептидная цепь, содержащая определенное число участков вторичной структуры, обычно укладывается в пространстве в относительно компактную систему, в которой элементы вторичной структуры взаимодействуют между собой и с участками неупорядоченной структуры, образуя глобулу (глобулярные белки) или достаточно вытянутое волокно (фибриллярные белки). В этих случаях принято говорить о формировании третичной структуры. Для многих белков третичная структура эквивалентна полной пространственной структуре. Каждый белок обладает своей уникальной пространственной структурой.

Главным методом, с помощью которого в настоящее время определяется третичная структура белка, является рентгеноструктурный анализ кристаллических образцов. Рентгеноструктурный анализ сегодня является самым точным и мощным методом расшифровки пространственного строения белков (нередко разрешение достигает 0,15 — 0,2 нм). Этим методом к настоящему времени расшифровано строение более 200 белков.

Метод основан на дифракции рентгеновских лучей на периодической решетке, создаваемой упорядоченно расположенными атомами кристалла. В большинстве случаев самым трудным является получение кристалла биополимера требуемого размера и качества. Необходимым условием является использование излучения с длиной волны, соизмеримой с межатомными расстояниями в кристалле. Поэтому основное применение для решения такого рода задач нашли рентгеновские дифрактометры. В аппаратах этого типа пучок рентгеновского излучения рассеивается на атомах кристаллической решетки, создавая интерференционную картину. В некоторых направлениях происходит гашение волнового сигнала, в некоторых — усиление, создающее интенсивное рентгеновское пятно. Рассеянное излучение может быть зарегистрировано либо с помощью фотопленки, чувствительной к рентгеновскому излучению, либо с помощью счетчиков рентгеновского излучения. Изменяя направление падающего излучения, можно получить информацию обо всех возможных вариантах интерференционной картины. Обычно направление излучения варьируют, вращая кристалл. Измеряемыми параметрами являются координаты реплик и интенсивность рассеянного излучения. Соответствующий математический аппарат и программное компьютерное обеспечение позволяют перейти от дифракционных реплик к координатам атомов. Все полученные к настоящему времени структуры хранятся в международной базе данных белковых структур Protein Data Bank (PDB), к которой имеется свободный доступ. Рассеяние рентгеновского излучения происходит за счет его взаимодействия с нековалентными внутренними электронами атомов вещества. Поэтому часто в исследуемый объект вводят атомы тяжелых элементов, проводя так называемое изоморфное замещение. Если тяжелый атом обладает значительной электронной плотностью, изменение дифракционной картины будет существенным. По этой причине рентгеноструктурный анализ не дает информацию о положении протонов или атомов водорода. Достижение высокой (0,2 нм) и низкой (0,5 нм) плотности разрешения зависит от многих факторов, таких как качество кристалла и степень упорядоченности молекул в кристаллической упаковке. Большую роль играет точность измерения интенсивности излучения. В белках существуют области с высокой подвижностью, такой, что даже при полной кристаллизации не происходит «замораживания» структуры. Эти области в рентгеноструктурном анализе проявляются как участки с пониженным разрешением. Для характеристики разрешения вводится так называемый В-фактор, который позволяет идентифицировать области высокой подвижности. Ограничение рентгеноструктурного анализа связано с тем, что структурная информация может быть получена только для кристаллического вещества. В кристалле белка молекулы плотно упакованы; состояние кристалла характеризуется большими концентрациями компонентов. Это может повлиять на качество результатов рентгеноструктурного анализа биополимерных молекул. В течение долгого времени шла дискуссия о том, можно ли на основе рентгеноструктурных данных делать вывод о строении молекул белка в растворе. Пришли к мнению, что искажения, которые вносит кристаллизация, относительно невелики, и можно считать, что рентгеноструктурный анализ дает адекватную атомарную структуру белка.

ЯМР-спектроскопия — спектроскопический метод исследования химических объектов, использующий явление ядерного магнитного резонанса. Образец вещества для ЯМР помещается в тонкостенную стеклянную трубку (ампулу). Когда ее помещают в магнитное поле, ЯМР активные ядра (такие как ¹H или ¹³C) поглощают электромагнитную энергию. Резонансная частота, энергия абсорбции и интенсивность испущенного сигнала пропорциональны силе магнитного поля. Большинство последних инноваций в ЯМР спектроскопии сделаны в так называемой ЯМР спектроскопии белков, которая становится очень важной техникой в современной биологии и медицине. Общей задачей является получение 3-мерной структуры белка в высоком разрешении, подобно изображениям получаемым в рентгеновской кристаллографии. Из-за присутствия большего числа атомов в белковой молекулы в сравнении с простым органическим соединением, базовый ¹H спектр переполнен перекрывающимися сигналами, поэтому прямой анализ спектра становится невозможным. Поэтому были разработаны многомерные техники, чтобы решить эту проблему. Чтобы улучшить результаты этих экспериментов применяют метод меченых атомов, используя ¹³С или ¹⁵N. Таким образом становится возможным получить 3D-спектр белкового образца.

Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) при использовании современных подходов позволяет полностью расшифровать пространственное строение пептида или небольшого белка с молекулярной массой до 10 000 — 15 000. Конечно, необходимыми условиями являются наличие хорошей приборной базы (прибор с рабочей частотой для протонов 300 — 500 МГц), правильная стратегия исследования применительно к конкретному объекту и достаточное количество вещества (~ 1 мкмоль пептида или белка).

Важнейшим этапом является отнесение сигналов в спектре 'Н-ЯМР. Сначала анализируются двумерные спектры, например COSY (корреляционная спектроскопия химических сдвигов, COSY), которые содержат всю информацию о спин-спиновых взаимодействиях (передаваемых через химические связи) между протонами молекулы. Эффективность такого взаимодействия протонов, характеризуемая константой спин- спинового взаимодействия, быстро падает с увеличением числа разделяющих их ковалентных связей и обычно становится ненаблюдаемой уже для четырех связей. Поэтому сигналы протонов аминокислотных остатков можно классифицировать по типам спиновых систем в зависимости от числа атомов водорода при углеродных

атомах Сα, Сβ, Сγи т. д. Затем анализируются двумерные спектры ядерного эффекта

Оверхаузера (сокращенно NOESY), которые содержат всю информацию о диполь- дипольных взаимодействиях между пространственно сближенными протонами молекулы. Величина ядерного эффекта Оверхаузера обратно пропорциональна шестой степени расстояния между ядрами и для пептидов и для небольших белков становится

пренебрежимо малой при расстояниях ^ 0,4 — 0,5 нм. Основываясь на известной аминокислотной последовательности белка или пептида, спиновые системы протонов (отнесенные к определенным типам аминокислотных остатков) «соединяют» между собой, выявляя диполь- дипольные взаимодействия между протоном NH (i + 1)- го остатка и протонами NH, СαН и СβН предыдущего i- ro остатка. Следуя таким образом вдоль полипептидной цепи, получают полное отнесение сигналов в спектре 'Н- ЯМР

к определенным остаткам аминокислотной последовательности. Одновременно с отнесением сигналов в двумерных спектрах 'Н- ЯМР получают практически всю необходимую информацию для реконструкции пространственной структуры белка в растворе. Анализ ядерного эффекта Оверхаузера между протонами удаленных по аминокислотной последовательности остатков дает возможность выявить элементы вторичной структуры белка (α-спирали, β-структуры, β-изгибы). Существенное значение имеет обнаружение внутримолекулярных водородных связей, характерных для вторичной структуры белков и пептидов. Для этого изучают скорость обмена атомов водорода группы NH с растворителем (например, дейтерообмен) и таким образом получают

данные об их доступности внешней среде. На заключительном этапе вся совокупность полученных данных (константы спин- спинового взаимодействия, ядерный эффект Оверхаузера, доступность протонов NH внешней среде) анализируется с помощью специальных программ на ЭВМ, учитывающих длины валентных связей, валентные углы, ван- дер- ваальсовы радиусы атомов и т. д. Как правило, при этом удается достаточно точно выяснить конформацию основной полипептидной цепи и наиболее вероятную ориентацию боковых радикалов. Особую ценность представляет информация, получаемая с помощью спектроскопии ЯМР, о динамических характеристиках пространственной структуры молекулы, ее изменениях в результате изменения среды (рН, температура, ионная сила) или взаимодействия с другими молекулами.

Четвертичная структура белков. Примеры гомомерных и гетеромерных белков. Методы исследования четвертичной структуры

Многие белки состоят из субъединиц, одинаковых или различных, образующих трехмерные ассоциаты или более сложные ансамбли. В этом случае принято говорить о четвертичной структуре белков. Специфичность четвертичной структуры данного белка

обусловливается выполняемой им биологической функцией, а взаимодействие субъединиц обеспечивает дополнительный механизм ее регуляции.

Примеры гомомерных белков: глутаминсинтетаза (12 субъединиц образуют два гексагональных кольца), белок оболочки вируса табачной мозаики (2130 субъединиц)б микрофиламенты (актин).

Примеры гетеромерных белков: гемоглобин (α2β2), аспартат-транскарбамоилаза (12 субъединиц — 6 каталитических (С- субъединицы) и 6 регуляторных (R- субъединицы), С- субъединицы объединены в тримеры, расположенные один над другим, а R-субъединицы находятся на периферии молекулы, взаимодействуют друг с другом и с С- субъединицами), ДНК-зависимая РНК-полимераза (2 α, 1 β, 1 β’, 1 δ субъединицы), нуклеосомы (гистоны H2A, H2B, H3, H4), микротрубочки (α и β субъединицы тубулина).

Первый этап исследования четвертичной структуры белка — анализ его субъединичного состава. Для этого необходимо провести диссоциацию белка на отдельные субъединицы, что обычно достигается с помощью гидрохлорида гуанидина, мочевины или додецилсульфата натрия (с добавлением меркаптоэтанола для восстановления дисульфидных связей). Во многих случаях диссоциации способствуют изменение рН среды, добавление соли, замена воды на органические растворители, а также химическая модификация белка. Субстраты, различные метаболиты и кофакторы в разных белках влияют как на ассоциацию, так и диссоциацию субъединиц. Субъединичный состав белка может быть выяснен путем сопоставления его суммарной молекулярной массы с молекулярными массами отдельных субъединиц (установленными с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), а также с числом N- и С- концевых аминокислотных остатков. Другой метод анализа заключается в сравнении числа пептидов (N), ожидаемых на основании данных аминокислотного состава, с числом реально образующихся при том или ином специфическом гидролизе молекулы белка.

Процесс формирования четвертичной структуры белков проходит в соответствии со строгими законами термодинамики. Силы, способствующие ассоциации белка, должны быть скомпенсированы таким образом, чтобы активные группировки, расположенные в

областях, имеющих тенденции к ассоциации, не оставались экспонированными наружу. В белках, построенных из одинаковых субъединиц, последние практически всегда находятся в эквивалентном (или идентичном) окружении. Взаимодействие между комплементарными участками субъединиц в четвертичной структуре осуществляется с помощью ван-дер-ваальсовых сил, ионных и водородных связей. Формирование четвертичной структуры из трех и более субъединиц протекает с промежуточным образованием агрегатов меньшего размера. Агрегация первых мономеров часто облегчает присоединение последующих — в этом смысле образование четвертичной структуры является кооперативным процессом.

Имеется ряд физико- химических методов исследования геометрии субъединиц в белках, обладающих четвертичной структурой. Наиболее информативный среди них — метод рентгеноструктурного анализа. Классическими являются рентгеноструктурные исследо-

вания гемоглобина, проводившиеся в Кембридже М. Перутцем и сотр. в течение 25 лет, начиная с 1937 г. Была установлена субъединичная структура гемоглобина — α2β2. С каждой субъединицей связано по одной гем-группе, атом железа которой может обратимо связывать молекулу О 2. Контакты образуются преимущественно между α- и β- и в меньшей степени между α—α- и β—β- цепями белка. Большинство контактов возникает за счет взаимодействия гидрофобных боковых цепей аминокислотных остатков, часть из них обусловлена водородными и электростатическими связями.

Электронная микроскопия — информативный метод анализа четвертичной структуры белков, особенно крупных молекул со многими субъединицами. Главные ограничения метода — сравнительная «прозрачность» белков по отношению к пучку электронов и

их недостаточная стабильность в условиях эксперимента. Обычно удается проводить структурный анализ с разрешением до 2 нм, а при соблюдении определенных предосторожностей — до 1 нм.

Совместное использование электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа дало возможность установить четвертичную структуру еще более сложно устроенного фермента — аспартат-транскарбамоилазы E.coli, катализирующего основную реакцию в

биосинтезе пиримидиновых нуклеотидов — образование N- карба-

моиласпарагиновой кислоты из аспарагиновой и карбамоилфосфор-

ной кислот.

Для исследования четвертичной структуры белков широко используется химическая модификация, в частности, бифункциональными реагентами. С помощью такого подхода была изучена пространственная структура ДНК- зависимой РНК- полимеразы E.coli.

Проводилась модификация бифункциональными реагентами как самого фермента, так и его комплекса с фрагментами ДНК- матрицы, содержащими промоторные участки. В последнем случае использовались фрагменты ДНК, несущие фоточувствительные группировки (частично депуринизованные или содержащие остатки 5- бромурацила).

 

Возникает вопрос: почему многие белки состоят из субъединиц? Какие преимущества это дает по сравнению с одной длинной пептидной цепью? Во-первых, наличие субъединичной структуры позволяет «экономить» генетический материал. Для олигомерных белков, состоящих из идентичных субъединиц, резко уменьшается размер структурного гена и соответственно длина матричной РНК. Во- вторых, при сравнительно небольшой величине цепей уменьшается влияние случайных ошибок, которые могут возникнуть в процессе биосинтеза белковых молекул. В- третьих, наличие субъединичной структуры у многих белков позволяет клетке легко регулировать их активность, например, путем смещения равновесия ассоциация — диссоциация в ту или иную сторону. Наконец, субъединичная структура облегчает и ускоряет процесс молекулярной эволюции. Мутации, приводящие лишь к небольшим конформационным изменениям на уровне третичной структуры за счет многократного усиления этих изменений при переходе к четвертичной структуре, могут способствовать появлению у белка новых свойств.

Характерной особенностью белков с четвертичной структурой является их способность к самосборке. Легко происходит, например, самосборка гемоглобина из смеси α- и β- цепей. Таким образом, в аминокислотной последовательности полипептидных цепей олиго-

мерного белка закодированы как бы два уровня информации: один из них определяет трехмерную структуру отдельных полипептидных цепей, а второй, поскольку каждая субъединица содержит специфические участки связывания с другими субъединицами, определяет четвертичную структуру всей многокомпонентной молекулы в целом.