Принципы негативного и позитивного контроля регуляции активности генов у прокариот. Особенности регуляции генов у эукариот.

Доказательства генетической роли нуклеиновых кислот в передаче наследвственной информации(трансформация, трансдукция, лизогения)

Раньше считалось что белок является носителем наследственной информации, а ДНК слишком проста в строении чтобы отвечать за наследственность. Но в 20-е года XX столетия были сделаны открытия, ставшие революционными в генетике: микроорганизмы стали новыми объектами генетики.Преимущества микроорганизмов: быстрая смена поколений, простота получения изменчивости, простота организации.

Явление трансформации у микроорганизмов: Гриффитс исследовал 2 штамма бактерий- пневмококков. Они образовывали на твердой питательной среде колонии разной формы и по разному действовали на подопотных мышей: вирулентный капсульный штамм вызывал пневмонию у мышей(их гибель), не верулентный бескапсульный-был безвреден. Способность вызывать пневмонию связывалось с наличием капсулы. Гриффит проводил эксперименты на мышей:вводил живые бесскапсульные и убитые нагреванием капсульные формы и мышь выживала. Маккарти, Мак- Леод и Эйверн обнаружили вещество в изобилии в хромосомах и во всех половых клетках –ДНК. Т.об. явление передачи признаков от одного штамма и вида к другому-это трансформация, с 1944 г. Возникла новая отрасль естествознания-молекуляр. биология. Для успешного осуществления трансформации, т.е. передачи клетке-реципиенту гена клетки донора с помощью ДНК необходимы некоторые условия: 1) мол-лы ДНК или их фрагменты должны быть довольно крупными 2)молекулы должны сохранять свое двуспиральное строение 3)ДНК донора полностью или частично гомологична ДНК реципиента, поэтому трансформация удается только между особями разного генотипа в пределах вида или между особями близких видов. Клетки реципиента трансформируются только когда они восприимчивы к трансформирующей ДНК, такое их физиологическое состояние называется компетентностью.

Процесс трансформации состоит из нескольких этапов: 1)донорная ДНК адсорбируется на компетентных реципиентных клетках, начинается вхождение ДНК в клетки 2)у бактерий проникновение ДНК имеет характер активного втягивания молекулы, осуществляемого клеточными белками 3)фрагмент донорной ДНК, проникший в клетку реципиента, включается в ее хромосому(включается всегда только одна из двух нитей трансформирующегося фрагмента)

Трансдукция и лизогения: перенос фрагмента ДНК клетки донора в клетку реципиент осуществляют вирусы. Вирусы бактерий- бактериофаги(фаги), делятся на вирулентные и умеренные. При заражении вирулентным вирусом, хромосома фага проникает в клетку и реплицируется, в клетки синтезируются белки фага, фаговая ДНК одевается этими белками, стенки клетки разрываются и новые фаговые частицы выходят в окружающую среду (Это продуктивная инфекция).

Умеренный фаг может вызывать такую же продуктивную инфекцию или фаговая хромосома попав в клетку встраивается в хромосому бактерий т.е. превращается в профаг и реплицируется вместе с этой хромосомой. Бактерия несущая профаг называется лизогенной, а явление лизогенией. Бактерия остается жизнеспособной, при делении дает новые поколения лизогенных клеток.

Различают 2 вида трансдукции: 1)Общую(неспецифическую) 2)Ограниченную(специфическую). Общая:фаг, размножающийся в бактерии и разрушающий ее способен захватить любой участок ДНК и перенести его в другую бактерию и встроится в ее хромосому. Ограниченная:осуществляют только те умеренные фаги, которые при переходе в состояние профага встраиваются в определенное место бактериальной хромосомы.

Болезни импринтинга

Генетический импринтинг (от англ. imprint – отпечатывать, запечатлевать) – специфическое изменение некоторых участков отдельных хромосом во время гаметогенеза. Механизм импринтинга связан с метилированием цитозиновых оснований ДНК, что приводит к выключению транскрипции соответствующего гена (группы генов). В результате у потомков может фенотипически проявляться информация гена, полученного только от одного родителя, тогда как аллельный ген другого родителя не экспрессируется (феномен моноаллельной экспрессии).
В настоящее время эффект импринтинга выявлен в отношении нескольких хромосом человека (7, 11, 14, 15). Так, например, в длинном плече хромосомы15 есть участки, импринтинг которых связывают с возникновением двух различных синдромов – синдрома Прадера-Вилли и синдрома Ангельмана (тяжелые формы умственной отсталости, сопровождающейся патологическими изменениями ряда органов и тканей). Механизм синдрома Прадера-Вилли связан с импринтингом участка материнской хромосомы 15. В большинстве случаев болезнь возникает при появлении делеции в гомологичном сегменте этой хромосомы, которую индивид унаследовал от своего отца. При синдроме Ангельмана, наоборот, импринтингу подвергается сегмент отцовской хромосомы 15, а болезнь возникает в результате делеции в этом же участке материнской хромосомы.

Принципы диагностики, лечения и профилактики наследственных болезней
Принципы диагностики наследственных болезней человека основаны на раннем выявлении мутационных изменений в хромосомах и в отдельных генах, приводящих к формированию патологического фенотипа. В рамках дородовой (пренатальной) диагностики используются различные инвазивные методы (амниоцентез, биопсия хориона и плаценты, кордоцентез) и неинвазивные методы (УЗИ, обнаружение биохимических и иммунологических маркеров в крови беременной женщины и др.). Используются также современные молекулярно-генетические методы (генная диагностика). В послеродовом (постнатальном) периоде актуален принцип массовой («просеивающей») диагностики наследственных заболеваний в больших группах новорожденных с использованием различных методов.

Принципы лечения наследственных болезней человека предусматривают терапевтическое воздействие на причину заболевания (этиотропное лечение), на механизм развития болезни (патогенетическое лечение) и на отдельные симптомы болезни (симптоматическое лечение). В рамках этиотропного лечения активно разрабатываются новые методы генной терапии, основанные на замещении мутантного белка, с которым связано развитие болезни, на соответствующий нормальный белок. С этой целью в клетки больного человека вводят нормальный ген (трансген), находящийся в составе генно-инженерной конструкции, т.е. экспериментально сконструированной гибридной молекулы ДНК.

Профилактика наследственных болезней человека проводится по двум направлениям. Первое из них связано с предупреждением появления новых мутаций (мутационного груза), возникающих в клетках под воздействием мутагенов. В рамках этого направления проводят мероприятия по охране окружающей среды от загрязнения мутагенами, тестирование на мутагенность компонентов, непосредственно контактирующих с организмом человека (пищевые продукты, лекарства, косметика, бытовая химия и др.).

Второе направление связано с уменьшением распространения в популяциях человека мутантных генов, унаследованных от предыдущих поколений (сегрегационного груза). Эта проблема решается сегодня с помощью медико-генетического консультирования. В задачу последнего входит диспансеризация семей с наследственной патологией, анализ наследования заболевания в конкретной семье, установление генотипов отдельных членов семьи и риска рождения у них больного ребенка. На основе полученной информации супружеская пара может решать вопрос о целесообразности зачатия будущего ребенка либо сохранения беременности, если зачатие уже произошло. В случае сохранения беременности при наличии риска рождения больного ребенка такая информация необходима для работников медицинских учреждений (женская консультация, роддом, детская поликлиника) для ранней диагностики и своевременного лечения наследственного заболевания у ребенка.

Механизмы репарации

Система репарации является важным механизмом самозащиты генома, с их помощью целенаправленно уничтожаются различные структурные повреждения ДНК, приводящие к летальному эффекту или мутациям. К наиболее изученным повреждениям ДНК относят образования фотопродуктов при ультрафиолетовом излучении. Повреждения чаще всего приводят к образованию димеров из 2 соседних пиримидиновых оснований. Наиболее часто образуются димеры тимина, цитозина.

На исправление подобных дефектов направлены процессы дорепликативной репарации. Фотореактивация строго специфична и происходит с помощью фермента ДНК-фотолиазы, она образуется у различных организмов от бактерий до млекопитающих. Она обладает специфическим сродством к участкам ДНК, содержащих пиримидиновые димеры. При их обнаружении она связывается с такими последовательностями, связь происходит в темноте. Комплекс фотолиазы ДНК сохраняется неизменным до освещения его видимым светом. Под действием энергии света, фермент каталитически разрывает ковалентные связи между пиримидиновыми кольцами, восстанавливая структуру ДНК.

Принципы негативного и позитивного контроля регуляции активности генов у прокариот. Особенности регуляции генов у эукариот.

 

Механизмы регуляции и активности генов были открыты на микроорганизмах E.coli. Известно, что ферменты, необходимые для усвоения некоторых питательных веществ, начинают активно синтезироваться в бактериальной клетке только в их присутствии. Если в питательную среду для кишечной палочки добавить лактозу, через несколько минут бактерии начинают вырабатывать ферменты, необходимые для ёё проникновения в клетку и утилизации. После удаления лактозы синтез ферментов полностью прекращается. Данный тип адаптивной регуляции наблюдался при синтезе катаболических ферментов, осуществляющих превращение поступающих в клетку извне сложных веществ в простые. Другой тип регуляции синтеза ферментов: когда накопление в клетке излишних количеств продуцируемого ей вещества прекращает образование фермента, с помощью которого это вещество синтезировалось. В этом случае синтез ферментов репрессируется веществом, представляемым продукт их действия. Такой тип регуляции характеризует синтез анаболических ферментов, участвующих в образовании сложных органических соединений. Оба механизма работают по принципу обратной связи и обеспечивают синтез ферментов в клетке только в условиях, когда они ей необходимы. И приостанавливают синтез, когда потребность в них исчезает. Это позволяет клетке избежать ненужного расхода материалов и энергетических ресурсов клетки.

Генетические механизмы индукции и репрессии синтеза ферментов у микроорганизмов были выявлены французскими генетиками Ф. Жакобом и Ж. Моно. Сделанные ими выводы оказались верны не только для белков прокариот, но и послужили основой для построения общей теории генетической регуляции белкового синтеза, в основных чертах справедливой и для эукариот.

Главное положение теории:

В ДНК, кроме последовательностей, кодирующих структуру синтезируемых клеткой макромолекул (полипептиды, молекулы рРНК, тРНК) и называемых структурными генами, существуют ещё последовательности нуклеотидов, не имеющие кодирующей функции, но с помощью присоединяющихся к ним различных белковых факторов управляющие работой структурных генов – регуляторные гены. Один или несколько структурных генов, расположенных в бактериальной хромосоме рядом с группой регуляторных генов, представляет собой единицу генетической регуляции – Оперон.

Общее строение lac-оперона начинается с участка Промотора, который разделён на 2 части. К первой присоединяется катаболический активаторный белок – CAP-белок, который активируется цАМФ (циклич.). Если её концентрация понижена, то CAP-белок не может присоединяться к промотору. Поэтому цАМФ представляет собой сигнальное вещество, не участвующее непосредственно в работе оперона, но необходимое для его запуска. Ко 2-й части промотора присоединяется РНК-полимераза, которая продвигается по оперону, транскрибируя его.

 

Строение лактозного оперона у кишечной палочки:

		Промотор		Оператор		Структурные гены

 

Сайт Cap

Сайт посадки РНК-полимеразы

Сайт посадки репрессора

z

y

a

3' Направление транкрипции 5'

 

Второй участок – оператор, с которым связывается белок-репрессор, тормозящий транскрипцию.

Структурные гены – кодируют строение ферментов, участвующих в усвоении лактозы. В lac-оперон входит 3 структурных гена:

1) Ген z – кодирует фермент β-галактозидазу, которая расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу;

2) Ген y – кодирует фермент галактозид-пермиазу, который переносит лактозу через мембранные клетки;

3) Ген a – кодирует фермент галактозид-транс-ацитилазу, который ацитилирует галактозу.

Все 3 структурных гена считаются совместно РНК-полимеразой, которая образует 1 транскрипт. Образование 3-х разных ферментов происходит притрансляции в соответствие с содержащимися в мРНК инициирующими и терминирующими кодонами. Заключительный участок оперона – Терминатор, который служит СТОП-сигналом, прекращающим транскрипцию.

Основная регуляция работы структурных генов осуществляется белком-репрессором, который кодируется геном, не входящим в состав оперона. Белок-репрессор непосредственно в небольшом количестве синтезируется в клетке. Одновременно в цитоплазме могут находиться до 10 его молекул. Он обладает сродством с оператором и, если в питательной среде нет лактозы, он прикрепляется к оператору и преграждает путь РНК-полимеразе к структурным генам. Оперон оказывается заблокированным. Если в среде появляется лактоза, белок–репрессор помимо оператора, имеет сродство и с лактозой. Поэтому он связывается с ней, изменяет свою структуру и теряет способность соединяться с оператором. РНК-полимераза продвигается к структурным генам, транскрибирует оперон, начинается синтез ферментов, необходимых для усвоения лактозы. После исчезновения лактозы из клетки белок-репрессор освобождается от неё, меняет свою структуру и приобретает сродство с оператором, соединяется с ним, преграждает путь РНК-полимеразе, транскрипция прекращается. Индукция в данном варианте вызвана тем, что белок-репрессор в комплексе с эффектором не может присоединяться к оператору. Такой тип регуляции – Негативная индукция. В основе негативной репрессии лежит прикрепление к оператору комплекса белка-репрессора с эффектором, которым является конечный продукт оперона. Пример: работа триптофанового оперона, который состоит из 5-ти структурных генов, участвующих в синтезе триптофана. Ген-репрессор, находящийся вне оперона, обеспечивает постоянный синтез в клетке небольшого количества репрессора. До тех пор, пока клетка успевает расходовать на свои потребности весь триптофан, белок-репрессор не влияет на работу оперона. Если в клетке появляется избыток триптофана, он соединяется с белком-репрессором, изменяющим его структуру, он приобретает сродство с оператором, связывается с ним и преграждает дорогу РНК-полимеразе. Транскрипция продолжается до тех пор, пока к клетке не израсходуется избыток триптофана. Освободившийся от триптофана, репрессор теряет сродство с оператором и открывает путь РНК-полимеразе, которая продвигается к структурнымгенам и начинает транскрипцию.

Кроме негативной, известна Позитивная генетическая регуляция. Отличие от негативной в том, что белок-репрессор не запрещает транскрипцию оперона, а активирует её. Позитивная индукция наблюдается в опероне кишечной палочки, кодируемом ферменты, необходимые для усвоения Арабинозы. В состав этого оперона входят 3 структурных гена. Эффектор – арабиноза. При её поступлении в среду, она связывается с белком-репрессором, изменяющим его структуру, он теряет способность связываться с оператором, но этот комплекс приобретает способность связываться с промоторной областью, прикрепляется к ней и активирует структурные гены, превращаясь из репрессора в активатор.

Регуляция экспрессии генов у эукариот протекает намного сложнее. Различные типы клеток многоклеточного эукариотического организма синтезируют ряд одинаковых белков и в то же время они отличаются друг от друга набором белков, специфичных для клеток данного типа. Уровень продукции зависит от типа клеток, а также от стадии развития организма. Регуляция экспрессии генов осуществляется на уровне клетки и на уровне организма.

Гены эукариотических клеток делятся на два основных вида: первый определяет универсальность клеточных функций, второй – детерминирует (определяет) специализированные клеточные функции. Функции генов первой группы прояв­ляются во всех клетках. Для осуществления дифференцированных функций специализированные клетки должны экспрессировать определенный набор генов.
Хромосомы, гены и опероны эукариотических клеток имеют ряд структурно-функциональных особенностей, что объясняет сложность экспрессии генов.

1. Опероны эукариотических клеток имеют несколько генов - регуляторов, которые могут располагаться в разных хромосомах.

2. Структурные гены, контролирующие синтез ферментов одного биохимического процесса, могут быть сосредоточены в нескольких оперонах, расположенных не только в одной молекуле ДНК, но и в нескольких.

3. Сложная последовательность молекулы ДНК. Имеются информативные и неинформативные участки, уникальные и многократно повторяющиеся информативные последовательности нуклеотидов.

4. Эукариотические гены состоят из экзонов и интронов, причем созревание и-РНК сопровождается вырезанием интронов из соответствующих первичных РНК-транскриптов (про-и-РНК), т.е. сплайсингом.

5. Процесс транскрипции генов зависит от состояния хроматина. Локальная компактизация ДНК полностью блокирует синтез РНК.

6. Транскрипция в эукариотических клетках не всегда сопряжена с трансляцией. Синтезированная и-РНК может длительное время сохраняться в виде информосом. Транскрипция и трансляция проис­ходят в разных компартментах.

7. Некоторые гены эукариот имеют непостоянную локализа­цию (лабильные гены или транспозоны).

8. Методы молекулярной биологии выявили тормозящее действие белков-гистонов на синтез и-РНК.

9. В процессе развития и дифференцировки органов активность генов зависит от гормонов, циркулирующих в организме и вызывающих специфические реакции в определенных клетках. У млекопитаю­щих важное значение имеет действие половых гормонов.

10. У эукариот на каждом этапе онтогенеза экспрессировано 5-10% генов, остальные должны быть заблокированы.