Оценка качества сырья, содержащего кумарины. Методы анализа

 

Выделяют кумарины из сырья экстракцией органическими растворителями, чаще всего метанолом или этанолом. Спиртовое извлечение очищают от сопутствующих веществ осаждением раствором свинца ацетата основного.

Качественный анализ.

Проводят качественные реакции и хроматографическое исследование, используя способность кумаринов:

- вступать в реакцию разрыва лактонного кольца (лактонная проба);

- давать окрашенные растворы с диазосоединениями;

- флуоресцировать в УФ-свете.

1. Лактонная проба (предложена Г.А. Кузнецовой). Реакция проводится с контрольным опытом. Извлечение, содержащее кумарины, наливают в две пробирки. В одну из них добавляют несколько капель 10 % раствора натрия гидроксида. Обе пробирки нагревают на водяной бане, затем в обе прибавляют по 5 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают. Если в пробирке, куда добавляли щелочь, раствор остался желтым и прозрачным, значит, реакция положительная, так как образуется желтая растворимая в воде соль кислоты кумаровой. В контрольной пробирке при добавлении воды раствор мутнеет, кумарины не растворяются в воде и выпадают в осадок. При подкислении щелочного раствора лактонное кольцо замыкается, и кумарины выпадают в осадок.

2. Реакция образования азокрасителя. Реакция проводится с продуктами, полученными после разрыва лактонного кольца. В пробирку добавляют несколько капель свежеприготовленного диазореактива. Чаще всего в качестве диазореактива используют диазотированную кислоту сульфаниловую. При наличии кумаринов раствор приобретает коричнево-красную или вишневую окраску (образуется азокраситель).

3. Реакция микросублимации. Поскольку, как было отмечено выше, при нагревании до 100 ºС кумарины возгоняются с образованием игольчатых кристаллов, для обнаружения их в сырье можно использовать реакцию микросублимации (методика – как для антраценпроизводных).

Игольчатые кристаллы (возгон) растворяются в спирте, затем проводится диазореакция.

Для идентификации кумаринов используют методы бумажной и тонкослойной хроматографии. При этом используют системы растворителей:

- н-гексан-бензол-метанол (5:4:1);

- петролейный эфир-бензол-метанол (5:4:1);

- н-бутанол-кислота уксусная-вода (4:1:5).

После высушивания хроматограммы сначала просматривают в УФ-свете. Кумарины в зависимости от структуры имеют голубую, синюю, фиолетовую, зеленую, желтую флуоресценцию. Флуоресцирующие пятна кумаринов отмечают, и хроматограммы обрабатывают 10 % спиртовым раствором щелочи, после чего их высушивают в сушильном шкафу при температуре 110-120 ºС в течение 2-3 мин и вновь просматривают в УФ-свете (как правило, флуоресценция усиливается). Затем хроматограммы опрыскивают свежеприготовленным реактивом Паули по Кутачеку (диазореактивом), от действия которого кумарины, в зависимости от структуры, окрашиваются в оранжевый, красно-оранжевый и фиолетовый цвета.

Количественное определение.

По существующей нормативной документации для количественного определения кумаринов в лекарственном растительном сырье используют физико-химические методы анализа.

1. Полярографический метод. Основан на восстановлении кумаринов на ртутно-капельном электроде в альфа -пироновом кольце по месту двойной связи в положении 3,4. Присоединяют галоген - йод, в качестве реактива используют тетраэтиламмония йодид.

Используют для определения содержания фурокумаринов в плодах пастернака посевного. Содержание кумаринов в пересчете на ксантотоксин не менее 1 %.

2. Спектрофотометрический метод. Основан на способности кумаринов поглощать монохроматический свет при определенной длине волны в зависимости от концентрации исследуемого раствора.

Используют для определения содержания простых кумаринов в траве донника лекарственного (не менее 0,4 %) и пиранокумаринов в корневищах и корнях вздутоплодника сибирского (не менее 3 %). Получают хлороформное извлечение из сырья и измеряют у него оптическую плотность с помощью спектрофотометра.

3. Хроматоспектрофотометрический метод. Применяют для определения содержания фурокумаринов в плодах амми большой, псоралеи костянковой и листьях инжира.

Стадии определения:

1. Получение хлороформного извлечения из сырья.

2. Разделение суммы кумаринов методом хроматографии на бумаге в системе растворителей, указанной в нормативной документации.

3. Идентификация кумаринов в УФ-свете по характерному свечению.

4. Элюирование веществ с бумаги. Каждое вещество отдельно элюируют 95 % этанолом.

5. Измерение оптической плотности растворов с помощью спектрофотометра при длине волны, указанной в нормативной документации.

6. Расчет содержания каждого соединения с учетом удельного показателя поглощения.

Плоды амми большой: бергаптена и изопимпинеллина не менее 0,6 %.

Плоды псоралеи костянковой: псоралена и изопсоралена не менее 0,9 %.

Листья инжира: псоралена и бергаптена не менее 0,7 %, отдельно псоралена не менее 0,42 %.