Молекулярні механізми генних, хромосомних і геномів мутацій

 

Мутаційна мінливість у людини. Молекулярні механізми генних мутацій. Класифікація генних мутацій. Поняття про моногенні спадкові захворювання. Молекулярні і цитологические механізми хромосомних мутацій. Сучасні методи вивчення каріотипу людини: диференційоване фарбування, FISH-метод і ін. Класифікація мутацій по причинах виникнення. Мутагенні чинники, методи визначення мутагенної активності речовин. Антимутагенез. Генератівниє і соматичні мутації.

 

Мутаційна мінливість у людини. Стабільність генетичного апарату і обумовлюваний цим апаратом консерватизм спадковості — лише одна сторона спадковості. Інша її сторона, така ж невід'ємна від живого, як і перша, — мінливість. В сукупності спадковість і мінливість забезпечили і збереження життя на Землі, і безперервну біологічну еволюцію. Спадкова мінливість організму забезпечує необхідну йому пристосовність до умов існування як в межах життя одного індивіда, так і в рамках існування біологічного вигляду в цілому. Спадкове різноманіття людини — результат тривалої еволюції живої матерії. При цьому треба мати на увазі особливості еволюції людини як біологічної і соціальної істоти. У людини як соціальної істоти природний відбір з часом протікав все в більш специфічних формах, що, безумовно, розширювало спадкову різноманітність популяцій. Зберігалося те, що могло «відмітатися» у тварин, або, навпаки, втрачалося те, що потрібне тваринним. Наприклад, повноцінніше забезпечення себе їжею і можливість задовольняти потребу у вітаміні С дозволили людині в процесі еволюції «загубити» ген L-гулонолактоноксидазы, що каталізує у тварин синтез аскорбінової кислоти. Наявність цього гена у тварин страхує їх від розвитку цинги, а людина із-за такої «загальної природженої помилки метаболізму» схильна до авітамінозу З. В процесі еволюції людина «набувала» і небажаних ознак, що мають пряме відношення до патології людини. Більшість видів тварин несприйнятлива до дифтерійного токсину і вірусу поліомієліту, тому що у тварин відсутні компоненти мембрани кліток, що забезпечують сприйняття того або іншого патогенного чинника. У людини ці компоненти є. Гени, що їх детермінують, вже ідентифіковані. Наприклад, для сприйняття дифтерійного токсину такий ген локалізований в 5-й, для вірусу поліомієліту — в 19-ій хромосомі.

Більшість мутацій збільшує поліморфізм людських популяцій (групи крові, колір волосся, зростання, розріз очей і ін.), але іноді мутації зачіпають життєво важливі функції, а це вже приводить до хвороби. Таким чином, спадкова патологія — частина спадкової мінливості, що накопичилася за час еволюції людини. Людина, ставши біологічним видом Homo sapiens (Людина розумна), як би заплатив за «сапиентацию» свого вигляду накопиченням патологічних мутацій. На основі цих положень формулюється одна з головних концепцій медичної генетики про еволюційне накопичення патологічних мутацій в людських популяціях. Підтвердженням цієї концепції є патологічні мутації у тварин, по своїх проявах схожі із спадковими хворобами у людини (ахондроплазии. гемофілії, м'язова дистрофія і ін.), а також наявність спадкових хвороб у людей, що жили декілька тисячоліть тому (про що можна судити по знахідках патологічних скелетів в розкопках і витворах мистецтва).

Еволюція будь-якого вигляду, у тому числі і людини, кінець кінцем, зводиться до еволюції генотипу. У біологічній еволюції людини хвороба як чинник природного відбору могла грати істотну роль, а еволюція генотипу у свою чергу міняла нозологію патологічних процесів. Залежність еволюції хвороби від еволюції генотипу навряд чи може викликати сумнів. Вище були приведені конкретні форми цієї залежності (цинга, дифтерія, поліомієліт). Чинники еволюції протягом тривалого часу впливали не тільки на формування біохімічних, імунологічних, фізіологічних або морфологічних властивостей організму, але і на його патологічні реакції, обумовлюючи значно більше різноманіття нозологічних форм хвороб у людини в порівнянні з такими у тварин.

Основним джерелом різноманіття спадкових ознак і їх безперервної еволюції служить мутаційна мінливість. Здатність ДНК мутувати склалася в еволюції і закріпилася відбором, мабуть, так само, як і здатність протистояти мутаційним змінам, тобто репарировать їх. У організації ДНК закладена можливість помилок її реплікації разом з можливістю зміни первинної структури. Вірогідність «збоївши» в точності реплікації молекули ДНК невелика: вона складає 10-5—10-7. Проте, зважаючи на виняткове велике число нуклеотидов в геномі (3,2 х 109 на гаплоидный набір), слід визнати, що в сумі на геном клітки на однієї неї покоління доводиться декілька мутацій в структурних генах. На думку різних авторів, кожен індивід успадковує 2—3 нових шкідливих мутації, яка може давати летальний ефект або підхоплюватися відбором, збільшуючи генетичну різноманітність людських популяцій.

Зміна нуклеотидной послідовності молекули ДНК може відбитися на первинній (амінокислотною) структурі білка або на регуляції його синтезу. Так, великий досвід вивчення молекулярної природи мутацій гемоглобіну показує, що значна частина таких мутацій не змінює функції гемоглобіну. Такі мутації нейтральні і не піддаються відбору. Інші мутації приводять до функціональних відхилень в молекулі білка. Ці відхилення в якихось умовах життя організму можуть виявитися корисними, тобто мати адаптивне значення, тому збережуться, а іноді і умножаться в подальших поколіннях. Саме таким шляхом виникали і зберігалися в популяціях різноманітні варіанти структурних, транспортних і ферментних білків організму. Властивий організму людини широкий білковий поліморфізм, завдяки якому кожен індивід біохімічно неповторюваний, обумовлений початково мутаційною мінливістю і відбором адаптивних білкових варіантів.

Проте, якщо структурні відхилення несумісні з виконанням білком його функції, а вона життєво важлива для клітки (організму), мутація стає патологічною і надалі або виключається з популяції разом з нежиттєздатною кліткою (організмом), або зберігається, обумовлюючи спадкову хворобу. В окремих випадках гетерозиготные носії патологічної мутації піддаються позитивному відбору. Прикладом цього служить ген серповидно-клітинної анемії, який широко розповсюдився в популяціях, що проживають в ендемічних по малярії районах, унаслідок великої стійкості гетерозиготных носіїв «аномального» гена (мутанта аллеля) до малярійного плазмодія.

Різні ознаки організму по-різному стійкі до мутаційних змін, що зв'язане, мабуть, із значенням ознаки і з його еволюційним «віком». Такі ознаки, як гистоновые білки, що входять до складу хромосом, або скоротливі білки актин і тубулин, або ферментні білки реплікації і транскрипції, вельми консервативні і однакові не тільки у різних представників людства, але і у біологічних видів значної віддаленості філогенезу. Мабуть, мутації у відповідних генах детальні. Більшість білків організму, особливо ферментних, існують в декількох изоформах і схильні до таких мутаційних змін, які ведуть до патології.

Патологічні мутації різні по здатності зберігатися і розповсюджуватися в популяціях. Одні з них, що дозволяють їх носієві зберігати плодючість і що не викликають серйозних несприятливих зрушень у фенотипе, можуть передаватися з покоління в покоління тривалий час. Такі ознаки сегрегируют (розподіляються) в поколіннях згідно законам Менделя, і обумовлений ними генетичний тягар в популяціях може довго зберігатися. Деякі комбінації умовно патологічних рецесивних аллелей можуть давати селективну перевагу індивідам (виживає, плодючість). Частота таких аллелей в популяції підвищуватиметься до певного рівня у ряді поколінь, поки не наступить рівновага між інтенсивністю мутаційного процесу і відбору. Частота різних мутантів аллелей цього роду може бути неоднаковою в різних популяціях, що визначається закономірностями популяцій (ефект родоначальника, частота кровноспоріднених браків, міграція і екологічні умови). Під ефектом родоначальника мають на увазі накопичення патологічних мутацій в обмеженій популяції від одного носія хвороби групі нащадків.

Якщо знов виникла мутація має домінантний патологічний прояв і веде до летального генетичного результату (індивід не залишає потомства), то такий мутаційний вантаж не передається наступному поколінню. Це звичайно домінантні форми важких хвороб, а також велика частина хромосомних хвороб.

В цілому ефекти генетичного тягаря у людини виражені в эволюционно- генетичних явищах збалансованого поліморфізму, летальності і пониженої фертильности.

На основі постійних протікаючих процесів зміни спадковості (мутацій) і відбору генотипів при тривалій еволюції людини в популяціях сформувався збалансований поліморфізм. Під цією назвою розуміють таке явище, коли в популяції представлено дві форми аллелей одного гена або більш, причому частота рідкісного аллеля складає не менше 1%. Оскільки виникнення мутацій — рідкісна подія (1 х 10-7), то, отже, частоту мутанта аллеля в популяції більше 1% можна пояснити тільки якоюсь селективною перевагою цього аллеля для організму і поступовим накопиченням у ряді поколінь після його появи. Прикладами збалансованого поліморфізму є групи крові АВО, резус, гени муковісцидозу, фенілкетонурії, первинного гемохроматоза. Генетичне різноманіття людини засноване на збалансованому поліморфізмі, що формувався протягом десятків і сотень тисячоліть. Таке різноманіття — основа розвитку людини як біологічного вигляду. Вірогідність виникнення і фіксації в популяціях якої-небудь мутації з позитивним ефектом в еволюційно «відладженому» людському організмі існує і в даний час, але вона украй мала. Практично нові мутації завжди дають негативний ефект.

До ефектів мутаційного вантажу відноситься летальність. Вона виявляється загибеллю гамет, зигот, ембріонів, плодів, смертю дітей. Найінтенсивніше летальні ефекти виражені в людських популяціях на рівні зигот. Приблизно 60% зигот гине до імплантації, тобто до клінічно реєстрованої вагітності. Результати всіх клінічно зареєстрованих вагітностей розподіляються таким чином: спонтанні аборти — 15%, мертвонародження — 1%, живородіння — 84%. З 1000 живонароджених дітей не менше 5 вмирають у віці до року унаслідок спадкової патології, несумісної з життям. Такий об'єм летального вантажу мутаційної мінливості в популяціях людини з медичної точки зору.

Для більшості спадкових хвороб характерна понижена фертильность, обумовлена порушенням репродуктивної функції. Це веде до зменшеного відтворення потомства (і хворого, і здорового) в сім'ях із спадковою патологією.

Медичні і соціальні наслідки мутаційного процесу: соціальна дизадаптация (інвалідність) хворих, підвищена потреба в медичній допомозі і понижена тривалість життя.

Молекулярні механізми генних мутацій. Генетичний матеріал — ДНК — дуже лабилен. Він може мінятися, мутувати в результаті як зовнішніх, так і внутрішніх дій. Підсумком виникаючих змін, якщо вони відбуваються в соматичних клітках (а вони відбуваються безперервно з найпершої хвилини існування нового людського організму — зиготы — до останньої хвилини його життя), є численні хвороби, включаючи ракові пухлини і, мабуть, старіння і смерть. Якщо ж вони відбуваються в клітках статевого шляху, то виникають мутації, які можуть в процесі еволюції закріплюватися і розповсюджуватися в популяції і приводити до поліморфізму, якщо вони не відсіваються через випадкові причини або через їх шкідливу дію на життєздатність індивідуума і його потомства.

В цілому різноманітність генів залежить від швидкості мутацій, розміру і демографічної історії популяції, в якій відбуваються мутації, часу, протягом якого відбувається накопичення цих відмінностей і селекції. Ступінь різноманітності, яка може підтримуватися в популяції, прямо пропорційний її розміру. Порівняно невелика вариабельность в популяції людини (вариабельность генома шимпанзе — нашого найближчого родича — значно вище, ніж у людини) є результатом її молодого віку і походження від порівняно невеликої початкової популяції.

Шкідливі мутації постійно виникають, але швидко відсіваються з популяції. Існує баланс між знов виникаючими мутаціями і їх відсіванням селекцією. В результаті шкідливі мутації, що викликають хворобу, володіють двома властивостями: вони зустрічаються рідко, і кожна конкретна мутація, що існує в популяції, виникла недавно. Що стосується звичайного поліморфізму, то механізм його підтримки в популяції, не дивлячись на тривалу і інтенсивну дискусію із цього приводу, неясний і, можливо, проясниться, коли вдасться достатньо швидко і порівняно недорого порівнювати безліч геномів і провести кореляції між частотами певних аллелей і історіями різних популяцій.

У молекулах ДНК може відбуватися зміни послідовності нуклеотидов. Такі зміни, якщо вони зачіпають функціонально активні гени, можуть приводити до порушень метаболізму або функцій (ознак). Якщо ці зміни не приводять до загибелі організму або клітки — вони можуть передаватися по спадку. Отже, генні мутації — це стабільні зміни структури генів, реплікації, що повторюються в подальших циклах, і що виявляються у потомства у вигляді нових варіантів ознак. Всі різновиди мутацій пов'язані із зміною нуклеотидной послідовності генів.

Класифікація генних мутацій. По особливостях структурних змін можна відзначити декілька груп різноманітних мутацій:

· заміна одних азотистих підстав іншими (транспозиція) (рис.33.);

· зміна кількості нуклеотидных пар в структурі гена (дупликация, инсерция, делеция);

· зміна порядку послідовності нуклеотидов у складі гена (інверсії);

· розрив ланцюгів;

· утворення зшивань.

 

Заміна азотистих підстав. Причинами цього роду мутацій є:

а) помилки реплікації

б) вплив певних хімічних агентів.

Під впливом хімічних агентів може відбуватися порушення структури азотистої підстави вже приєднаного нуклеотида. Наприклад, під впливом азотистої кислоти може відбуватися мимовільне дезаминирование цитозина. В результаті цього цитозин перетворюється на урацил. Надалі в циклі реплікації урацил з'єднується аденином, який в наступному циклі приєднує тимидиновый нуклеотид.

Ще однією причиною може бути помилкове включення в ланцюг ДНК нуклеотида, що утворюється, із зміненою підставою. Якщо це залишається непоміченим ферментами репарації, змінена підстава включається в процес реплікації, що може привести до заміни основної пари на іншу.

 

 

 

Ріс.33. Схема виникнення мутації (транспозиції) по механізму заміни однієї азотистої підстави іншим

 

Мутації в результаті заміни азотистих підстав виникають спочатку в одному з ланцюгів ДНК. Якщо вони не виправляються в ході репарації, то при подальших реплікаціях вони закріплюються в обох ланцюгах молекули. Наслідком цього є утворення нового триплета в генетичному коді ДНК. Це може відбитися на первинній структурі кодованого білка, його просторової організації і функції. Зміни первинної структури пептиду не відбудеться в тому випадку, якщо новий триплет є «синонімом» колишнього, тобто кодуватиме ту ж амінокислоту. Наприклад, амінокислота лейцин кодується шістьма триплетами: УУА, УУГ, ЦУУ, ЦУЦ, ЦУА, ЦУГ. Заміна одного з нуклеотидов в цих триплетах не змінить його «сенсу». Цей приклад демонструє біологічне значення надмірності генетичного коду. Проте в більшості випадків заміна однієї амінокислоти на іншу приводить до серйозних наслідків. Наприклад, заміна глутаминовой кислоти валином в молекулі гемоглобіну приводить до зміни його структури і функцій. В результаті цього у людини розвивається хвороба — серповидно-клітинна анемія. У ряді випадків заміна азотистих підстав може приводити до появи нонсенсу-кодону некодуючих амінокислот. Наслідком цього буде дострокове переривання процесу синтезу. Вважається, що заміна азотистих підстав приводять в - 25 % випадків до утворення триплетів-синонімів, в ~ 5 % випадків — до утворення нонсенс- кодонів, і в ~ 70 % — до виникнення генних мутацій.

Зміна кількості нуклеотидов в гені. Ця мутація — результат випадання (делеции) або вставки (инсерции) однієї або декількох пар нуклеотидов в молекулу ДНК (мал. 34). Такий тип мутацій зустрічається досить часто. Вказана зміна відбувається унаслідок дії на ДНК деяких хімічних агентів, а також радіоактивного опромінювання. Результатом цієї мутації є зрушення рамки прочитування інформації з генетичного коду. Наслідком цього є синтез поліпептидів із зміненою амінокислотною послідовністю, порушення структури і функцій білків, порушення фенотипа. Проте якщо кількість відновлених або втрачених нуклеотидов кратно трьом, то зрушення рамки не відбувається. В цьому випадку в білці може з'явитися зайва амінокислота або буде на одну менше. Одній з причин мутацій, що приводять до зміни кількості нуклеотидов, є вставки або делеции в результаті активності рухомих генетичних елементів. Це певні нуклеотидные послідовності, вбудовані в геноми багатьох організмів. Ці структури ДНК здатні мимоволі міняти своє положення в результаті помилок при рекомбінації.

 

 

Ріс.34. Схема зміни кількості нуклеотидов

 

Зміна нуклеотидной послідовності гена (інверсія). Цей тип мутації пов'язаний з поворотом певної ділянки ДНК на 180°. Такі порушення відбуваються унаслідок дії хімічних агентів і ряду фізичних чинників на молекулярно-генетичні
процеси реплікації і рекомбінації. Наслідком цього є порушення нуклеотидной послідовності гена. Це приводить до зміни первинної структури поліпептиду, порушення структури і функції білка, порушення фенотипа.

Розриви одного з ланцюгів можуть відбуватися під дією іонізуючої радіації, в результаті пошкодження хімічних зв'язків між нуклеотидами (мал. 35). Дефекти можуть відновлюватися ферментом лигазой.

 

 

 

Ріс.35. Схема виникнення мутації в результаті інверсії

 

Зшивання нуклеотидов, наприклад, два поряд тиминов, що стоять, відбувається під дією ультрафіолетового опромінювання. Це приводить помилкам транскрипції.

«Мутон». Цим терміном називають мінімальну кількість генетичного матеріалу, здібного до мутації, що приводить до появи нового варіанту ознаки. У вищевикладеному матеріалі приведені шовні типи мутацій. У всіх випадках видно, що досить змінити тільки одну пару комплементарних підстав в гені, щоб цінувати властивості білка. Тобто мутон відповідає одній парі комплементарних нуклеотидов.

Рекон. Цим терміном називають мінімальну кількість генетичного матеріалу, зміна якого в результаті рекомбінації кросинговера приводить до мутації і появи нового варіанту ознаки. Такі процеси можуть приводити до зрушення рамки прочитування порушенню синтезу необхідного білка. Наукові дослідження побувають, що достатньо рекомбінації однієї пари комплементарних нуклеотидов, щоб відбулася мутація. Отже, рекон відповідає одній парі комплементарних нуклеотидов.

Множинні аллели. Різні структурно- фунциональные варіанти гена називають аллелями. Вони відрізняються невеликими змінами в нуклеотидной послідовності. Це забезпечує варіації в прояві ознаки. Аллелі розташовуються в одних і тих в ділянках (локусах) гомологичных хромосом. Наявність в генофонді популяції більше двох варіантів аллельных генів називають множинними аллелями. Причиною множинного аллелизма є різноманітні мутації і рекомбінації. Мутації можуть відбуватися в будь-яких ділянках гена. Вони приводять до того, що один і той же ген може брати участь в декількох варіантах. Якщо мутації не викликають загибель організму, вони зберігаються в генофонді вигляду, чим обумовлюють появу нового варіанту ознаки в популяції.

Моногенні спадкові хвороби. Більшість форм спадкових захворювань обумовлена генними мутаціями, тобто молекулярними змінами на рівні ДНК (муковісцидоз, гемофілія, фенілкетонурія, нейрофіброматоз, міопатія Дюшенна і так далі). Це генні хвороби.

Мутації транскрибируемых ділянок (що визначають амінокислотну послідовність в молекулі білка, що синтезується) приводять до синтезу аномального продукту, тоді як мутації нетранскрибируемых областей можуть призводити до зниження швидкості синтезу незамінного білка різного ступеня вираженості. Фенотіпічеськи генні мутації можуть виявлятися на молекулярному, клітинному, тканинному і органному рівнях.

Множинність метаболічних шляхів, функцій білків в організмі, обмеженість наших уявлень про нормальний метаболізм утрудняють розробку обгрунтованої етіологічної класифікації генних хвороб. Навіть число генних хвороб можна визначити тільки орієнтування (3500— 4500), тому що немає строгих критеріїв нозологічних форм ні з клінічної, ні з генетичної точки зору. Наприклад, з клінічної точки зору міопатії Дюшенна (важка) і Беккера (легка). є різними формами, а з генетичної точки зору це результат мутації в одному і тому ж локусе. Встановлено, що міопатія Дюшенна розвивається при повній блокаді, а Беккера — при частковій блокаді синтезу РНК для дистрофина (при міопатії Беккера делеции гена за розміром менше).

Точніше можна говорити про ті гени, в яких ідентифіковані болезнь- обумовлюючі мутації. В даний час відомо близько 1100 таких генів. Проте можна чекати, що найближчим часом на основі знань генома людини процес виявлення генів і мутацій в них буде прискорений. У зв'язку з тим, що різні мутації в одному і тому ж гені часто приводять до порушень, що відрізняються, загальне число хвороб зі встановленою мутаційною природою можна вважати рівним 1500.

Те, що успадкувало патологічного гена (а у разі рецесивних мутацій — двох аллелей) не завжди супроводжується розгорненою клінічною картиною. Вище вже мовилося про можливий вплив чинників зовнішнього середовища на прояв генів. Проте і інші гени, що формують генотип особини, тобто генетичну конституцію індивіда, можуть модифікувати прояв патологічного гена. У таких випадках говорять про неповну пенетрантности і варіюючу експресивність. Оскільки генетичне середовище для патологічного гена завжди індивідуальне, виникають широкі можливості для різного прояву цього гена у різних індивідів.

Багато генних мутацій обумовлюють виникнення таких молекулярних форм білків, патологічна дія яких виявляється не в звичайних умовах, а тільки при взаємодії із специфічними чинниками зовнішнього середовища. Це так звані екогенетичні варіанти. Наприклад, у осіб з мутаціями в локусе глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при лікуванні сульфаниламидами виникає гемоліз еритроцитів, у осіб з аномальною холинэстеразой введення дитилина приводить до тривалої зупинки дихання.

У зв'язку з великим числом нозологічних форм генних хвороб, їх рідкістю, неповною клінічною і патологоанатомічною діагностикою спадкової патології дані по поширеності спадкових хвороб носять ще уривчатий характер. Проте по формах, по яких проводяться масові діагностичні або профілактичні програми, зібраний переконливий матеріал для думки про епідеміологію генних хвороб.

Загальна частота новонароджених з генними хворобами в популяціях в цілому складає приблизно 1%, з них з аутосомно-домінантним типом спадкоємства — 0,5%, аутосомно-рецессивным — 0,25%, Х-сцепленным — 0,25%; Y-сцепленные і мітохондріальні хвороби зустрічаються украй рідко.

Поширеність окремих форм хвороб коливається від 1:500 (первинний гемохроматоз) до 1:100 000 і нижче (гепатолентикулярная дегенерація, атаксия-телеангиэктазия і ін.).

Поширеність генної хвороби умовно можна вважати високою, якщо 1 хворий зустрічається на 10 000 новонароджених і чаші, середній, — 1:10 000— 1:40 000, низькою, — дуже окремі випадки. У групу поширених входить не більше 15 генних хвороб, але вони обумовлюють майже 50% обший частоти хворих із спадковою патологією.

Мутаційний процес — одна з біологічних характеристик будь-якого вигляду. Він постійно протікає у людини в зародкових і соматичних клітках і є основою виникнення і підтримки генетичної різноманітності людини. В той же час це первинне джерело виникнення спадкових хвороб. По різних оцінках, частота виникнення мутацій (спонтанний рівень) у людини орієнтування складає 1 х 10-3—1 х 10-7 генів на покоління, тобто мутаційні події в кожному гені достатньо рідкісні. Лише у декількох генах мутації виникають з підвищеною частотою (1 на 104 гамет). Ці гени відрізняються від інших незвичайно великими розмірами (360 000 пар нуклеотидов в гені нейрофіброматозу і 2х106 — в гені міопатії Дюшенна—беккера).

Таким чином, поточний мутаційний процес на генному рівні в одному поколінні не може забезпечувати спостережуваної високої частоти патологічних аллелей в популяціях. По приблизних непрямих оцінках (а точні прямі поки неможливі) загальний внесок мутаційного процесу в поширеність спадкових хвороб складає близько 20% їх загального числа.

 

 

 

Ріс.36. Схеми різної хромосомної аберації

 

Молекулярні і цитологические механізми хромосомних мутацій. Такі мутації пов'язані із зміною структури і розмірів хромосом. Їх також називають хромосомними перебудовами або хромосомною аберацією. Порушення структури хромосом є наслідком порушення процесів кросинговера, мейоза або митоза, а також дією інших чинників, що приводять до утворення фрагментів. Такі фрагменти можуть надалі навіть возз'єднатися, але без відновлення нормальної структури. Розрізняють внутри- і міжхромосомні перебудови. Серед внутрішньохромосомної аберації

виділяють наступні (рис.36.): делеция — брак внутрішніх ділянок хромосом; дупликация — подвоєння ділянок хромосоми; інверсія — поворот ділянки хромосоми на 180°; транслокация — переміщення ділянки з одного місця хромосоми в інше.

Причинами транслокаций є помилки молекулярно-генетичних процесів рекомбінації і ділення генетичного матеріалу. Міжхромосомні перестройки-транслокации пов'язані з переміщенням ділянки хромосоми, що відірвалася, на інше місце негомологичной хромосоми (хромосоми з іншої пари). Ділянка хромосоми, що відокремилася при розриві, може бути втрачений кліткою при черговому митозе, якщо він не мав центромеры. Але частіше такий фрагмент прикріпляється до однієї з хромосом. Розрізняють декілька видів транслокаций: а) реципрокные — взаємний обмін ділянками між негомологичными хромосомами, би) нереципрокные (транспозиції) — приєднання фрагмента до своєї ж хромосоми у іншому місці, в) полицентрические і ін.

Хромосомні перебудови приводять до зміни морфології хромосом, що помітно навіть в світловий мікроскоп. При цьому метацентричні хромосоми можуть перетворюватися на субметацентричних, акроцентрические, і навпаки. Можуть з'явитися кільця і полицентрические хромосоми.

Структурні перебудови хромосом статевих кліток змінюють генетичний баланс і генетичні програми розвитку і функціонування ембріона. Змінюється характер взаємодії генів і їх функціонування. Це негативно позначається на структурі і функції кліток, органів і приводить до серйозними наслідками. Часто мутації виявляються несумісними з розвитком нового організму або обумовлюють появу патологій. Проте деякі перебудови хромосом можуть бути корисними для еволюції. Наприклад, у людини 23 пари хромосом, а у сучасної людиноподібної мавпи 24 пари. Передбачається, що істотним етапом еволюції людини є робертсоновская транслокация — злиття 12 і 13 хромосом мавп, і утворення другої хромосоми людини, яка майже повністю відповідає по генетичному складу своїм попередникам. В результаті цього відбулася зміна числа пар хромосом і комбінацій генів, що, ймовірно, з'явилося одній з причин появи людини. Решта хромосом людини практично схожа з хромосомами шимпанзе, хоча є деякі відмінності, наприклад, перицентрические інверсії 4, 5, 12, 17 хромосом.

Хромосомна аберація виявляється цитогенетичним методом під світловим мікроскопом. У людини відома транслокационная форма хвороби Дауна, коли частина 21 хромосоми під час мейоза приєднується до 15-ої і разом з нею через гаметы потрапляє в зиготу, де з'являються три 21 хромосоми. Крупна хромосомна аберація в зиготах приводить до важких аномалій, несумісних з життям або загибелі зародків на початкових стадіях эмбриогенеза.

Сучасні методи вивчення каріотипу людини. Хромосомний комплекс вигляду зі всіма його особливостями: числом хромосом, їх формою, наявністю видимих в світловий мікроскоп деталей будови, генною і аллельным складом називається каріотипом. Специфічність набору хромосом для кожного виду. Всі живі організми мають постійне число специфічних хромосом в кожній соматичній клітці. Діплоїдноє число хромосом (2п) для людини — 46, для дрозофилы — 8, для коня — 66, шимпанзе — 48, собаки — 78 і так далі число (п) Гаплоїдноє для людини — 23, дрозофилы — 4 і так далі Гамети зазвичай містять тільки один набір хромосом.

Число хромосом в каріотипі індивідуума не залежить від висоти організації вигляду і не указує на спорідненість філогенезу, оскільки одна і та ж кількість хромосом може зустрічатися у дуже далеких один від одного видів. Особливість виявляється в тому, що кожен вид організмів має специфічний набір хромосом певної форми і розмірів. А головне, хромосоми організмів різних видів мають свій Унікальний набір генів, що визначають розвиток індивідуумів тільки безумовно вигляду.

Мікроскопічні методи вивчення хромосом людини застосовуються з кінця XIX століття. З'єднання цитологического спостереження хромосом з генетичним аналізом сегрегації і зчеплення генів привело до народження цитогенетики. Термін «цитогенетика» введений В. Саттоном в 1903 р. Спочатку цитогенетика концентрувалася на проблемах кореляції генетичних і цитологических (хромосомних) ознак. У подальшому цитогенетика методично відокремилася від генетики, і під терміном «цитогенетика» розуміють область науки, що вивчає структуру і функції хромосом.

Цитогенетичні методи призначені для вивчення структури хромосомного набору або окремих хромосом. Найбільш поширеним методом в цитогенетике людину є світлова мікроскопія. Електронна і конфокальная лазерна мікроскопія застосовується в сучасній цитогенетике тільки з дослідницькими цілями. У всій медико-генетической практиці застосовується світлова мікроскопія (головним чином в світлі, що проходить), включаючи люмінесцентну мікроскопію.

Об'єктом цитогенетичних спостережень можуть бути соматичні, що діляться, мейотические і интерфазные клітки. Кожен з цих об'єктів має переваги і недоліки. Вибір об'єкту визначається метою дослідження. Більшість цитогенетичних досліджень виконуються на соматичних клітках.

Отримання препаратів митотических хромосом. Перша головна умова цитогенетичної діагностики — наявність кліток, що діляться, в цитологическом препараті.

Кістковий мозок, тканини семенника і хорион мають достатній митотический індекс для того, щоб використовувати ці об'єкти для цитогенетичних цілей. Проте, як показав досвід, незрівнянно информативнее дослідження на культурах кліток: клітки звільнені від елементів сполучної тканини і добре суспендируются. Мітотічеський індекс в культурі кліток набагато вищий, ніж в тканинах організму.

Культури кліток можна отримувати з шматочків шкіри (ростуть фибробласты), кісткового мозку, ембріональних тканин, хориона, кліток амниотической рідини. Найбільш зручним об'єктом для медичних генетиків виявилася культура лімфоцитів периферичної крові. Для її отримання досить узяти 1—2 мл венозної крові і додати її в суміш живильного середовища з фитогемагглютинином (білок бобових рослин). Останній викликає імунологічну трансформацію лімфоцитів і їх ділення. Тривалість культивування складає 48-72 ч.

Другою методичною умовою цитогенетичних досліджень є використання колцемида (або колхицина), що руйнує веретено ділення і що зупиняє клітинне ділення на стадії метафази. Мітотічеський індекс в культурі кліток за 2—3 ч підвищується в 2—3 рази. Навіть без культивування експозиція з колцемидом збільшує число метафаз. Хромосоми у присутності колцемида коротшають за рахунок конденсації, що продовжується, і, отже, в препараті вони легше відділяються одна від одної. У тих випадках, коли необхідний детальний аналіз певного району хромосоми, хромосоми, що сильно конденсують, на стадії метафази (метод називається метафазным) непридатні для аналізу. Для цих цілей клітка повинна бути зафіксована на стадії, попередній метафазі, коли хромосома редуплицировалась, але ще не повністю конденсувалася. Ця стадія — стадія прометафазы. Хоча хромосоми на даній стадії погано роз'єднані (вони ще дуже довгі) і на препараті є багато накладень однієї хромосоми на іншу, все ж таки в окремих клітках можна знайти ділянку, необхідну для аналізу. Цей метод (або підхід) на відміну від метафазного методу називають прометафазным або методом высокоразрешающей цитогенетики. Суть методичного втручання при даній модифікації методу полягає в припиненні процесу тієї, що спіралізує і конденсації хромосом в профазе за допомогою препаратів, які вводять в культуру кліток за декілька годинників до фіксації.

Диференціальне фарбування хромосом. Метод простій забарвлення хромосом як єдиний метод вивчення каріотипу людини застосовувався до початку 70-х років. У 70-х роках до практики увійшли методи диференціального фарбування і хронології реплікації ДНК в хромосомах.

Диференціальне фарбування забезпечується порівняно простими температурно-сольовими діями на фіксовані хромосоми. При цьому виявляється структурне диференціювання хромосом по довжині, що виражається у вигляді чергування эу- і гетерохроматических районів (темні і світлі смуги). Протяжність цих ділянок специфічна для кожної хромосоми, відповідного плеча і району. Як видно з мал. 37.б, при диференціальному забарвленні ідентифікуються всі хромосоми, плечі і навіть певні райони. Кожна хромосома має свій малюнок покресленої. При диференціальному забарвленні метафазных хромосом в каріотипі можна оцінити близько 200-400 ділянок. Така вирішуюча можливість методу.

 

 

 

 

Ріс.37. Каріотипи при простій (а) і диференціальному (б) забарвленню

 

 

Спочатку при спеціальному фарбуванні хромосом використовували флюоресцентну алкилирующее речовину акрихін-Іприт. Цей варіант був названий Q-методом. Даний метод вимагає швидкої обробки препарату, що не завжди зручно. Для проглядання препарату треба користуватися люмінесцентним мікроскопом.

У подальшому була розроблена методика диференціального забарвлення без флюоресцентних фарбників. Найширше використовується G-окраска (Гимза). При цьому хромосоми заздалегідь обробляють (або інкубація в сольовому розчині, або обробка протеазой). Попередня обробка частково порушує структуру хромосом, яка в деяких ділянках відновлюється при забарвленні, що і додає хромосомі індивідуальну покреслену, або смугастість. Механізм утворення сегментів поки недостатньо ясний. Передбачається, що забарвлені сегменти — гетерохроматиновые, пізно реплицирующиеся ділянки хромосом з послідовностями ДНК, що повторюються, а незабарвлені — эухроматиновые ділянки, в яких розташовані кодуючі послідовності.

Для ідентифікації хромосом, крім методів виявлення лінійної структурної диференційованої, можна скористатися одній з важливих характеристик хромосом людини – асинхронностью їх реплікації по довжині (рис.38).

«Малюнки» послідовності реплікації (рано чи пізно реплицирующиеся ділянки) специфічні для кожної хромосоми. Для виявлення